2013年德宏州瑞麗市登革熱暴發(fā)疫情調(diào)查

2013年德宏州瑞麗市登革熱暴發(fā)疫情調(diào)查

登革熱（df）是由、、和引起的急性感染。主要通過埃及紅足虱（aedu3000抗癲癇）和白紋紅足虱（aedu3000寄生蟲）傳播，在世界溫帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行。近10年來,我國廣東、福建、浙江和江蘇等省曾發(fā)生過因輸入性病例引起的本地流行。云南省位于我國西南邊境地區(qū),與DF地方性流行區(qū)的越南、老撾、緬甸和泰國相鄰,邊境線長(zhǎng)4u3000060km,境內(nèi)外人員和物資交流頻繁,該病可通過多種方式傳播到云南省并引起流行。自2000年以來,云南省幾乎每年都有來自境外的DF輸入性病例的報(bào)告,2008年云南省瑞麗市還發(fā)生了該省歷史上最大的一起輸入性DF暴發(fā)。2013年瑞麗市首次發(fā)生本地DF暴發(fā),為掌握該起疫情的分子流行病學(xué)特點(diǎn),本課題組對(duì)患者血清標(biāo)本進(jìn)行了DENV核酸檢測(cè)及其基因序列分析。1u3000denv基因核苷酸基因型判定1.1病例資料DF病例資料來源于中國疾病預(yù)防控制中心疫情信息報(bào)告網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)以及登革熱病例個(gè)案調(diào)查表和流行病學(xué)調(diào)查資料。根據(jù)《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)病例進(jìn)行診斷,所有DF病例均為實(shí)驗(yàn)室診斷病例。人口數(shù)據(jù)來源于瑞麗市統(tǒng)計(jì)局。1.2病例定義輸入性病例:指本地?zé)oDF流行,發(fā)病前15d內(nèi)來自或到過有DF流行的國家或地區(qū)、有蚊蟲叮咬史的DF病例。本地感染病例:指發(fā)病前15d內(nèi)未離開過瑞麗市或未到過DF流行的國家或地區(qū)的DF病例。1.3標(biāo)本采集采集DF疑似和臨床診斷病例的急性期(發(fā)病后0~5d)血清。無菌真空采血管采集患者靜脈血液,經(jīng)3u3000000r/min離心5min,血清置于2ml螺旋蓋凍存管,立即進(jìn)行DENV抗原檢測(cè),其余血清標(biāo)本保存于-70℃冰箱。所有標(biāo)本的DENV-NS1抗原檢測(cè)均在瑞麗市疾病預(yù)防控制中心完成;分子生物學(xué)檢測(cè)在云南省地方病防治所病毒實(shí)驗(yàn)室完成。1.4u3000DENV-NS1抗原檢測(cè)NS1抗原檢測(cè)試劑為美國CTK生物有限公司產(chǎn)品。按說明書操作,在檢測(cè)卡上標(biāo)記病例編號(hào),取1滴血清或全血滴在加樣孔中,加1滴緩沖液到加樣孔中,25min內(nèi)讀取結(jié)果。當(dāng)質(zhì)控區(qū)和樣本區(qū)均出現(xiàn)條帶時(shí)則判為陽性;僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)條帶,而樣本區(qū)未出現(xiàn)條帶則判為陰性;如質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)條帶則試驗(yàn)無效。如在急性期血清中檢測(cè)到DENV-NS1抗原,表明該患者感染了DENV。1.5u3000DENVu3000RT-PCR試驗(yàn)用QIAampu3000ViralRNAu3000Miniu3000Kit(美國QIAGEN公司)提取患者血清中的病毒RNA,用Amershamu3000Bioscienceu3000Ready-To-GoTMu3000Youu3000Primeu3000First-Strandu3000Beads(美國Amershamu3000Pharmaciau3000Biotech公司)制備cDNA。取2μlu3000cDNA做反應(yīng)模板,以D1和D2為引物(表1),PCR擴(kuò)增目的基因,反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min,94℃30s、55℃30s、68℃30s,擴(kuò)增9個(gè)循環(huán)后,94℃30s、55℃30s、68℃30s(每個(gè)循環(huán)增加10s),擴(kuò)增25個(gè)循環(huán),68℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,取2μl產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,如果條帶分子量與預(yù)期片段大小相同,表明為相應(yīng)的DENV核酸擴(kuò)增陽性。1.6序列測(cè)定和分析本研究中所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。采用ClastalX1.83進(jìn)行核苷酸序列比對(duì),采用MEGA5軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)進(jìn)行DENV基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹分析。本研究引用國際基因庫(GeneBank)中來自不同國家和地區(qū)、不同年代的69株DENVu3000C/PreM區(qū)段核苷酸序列,其中Ⅰ型DENV為49株,Ⅱ型16株,Ⅲ型2株,Ⅳ型2株。2病例傳播時(shí)間12月至9月2.1流行概況及流行特征2013年8月3日,瑞麗市出現(xiàn)首例DF輸入性病例,8月30日首例本地感染DF病例被確診,末例病例發(fā)病時(shí)間為11月15日,流行期105d。共確診(實(shí)驗(yàn)室診斷)病例232例,其中本地感染145例,緬甸輸入87例(46例為緬甸邊民來我國就醫(yī)的患者,其余為中國人在緬甸打工者、商人及旅游者)。2013年瑞麗市DF發(fā)病率為124.30/10萬,而本地感染病例的發(fā)病率則為77.69/10萬。疫情波及瑞麗市城區(qū)和6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn),以該市城區(qū)發(fā)病數(shù)最多(53.45%,124/232),其次為姐告鎮(zhèn)(16.81%,39/232)和勐卯鎮(zhèn)(8.19%,19/232),而畹町鎮(zhèn)、弄島鎮(zhèn)、戶育鄉(xiāng)和姐相鄉(xiāng)僅各有1例,尚有46例為來瑞麗就醫(yī)的緬甸居民。月份分布:8月3例(1.29%),9月129例(55.60%),10月86例(37.07%),11月14例(6.04%),12月無病例,主要流行于9~10月,高峰為9月。本地感染病例主要集中在9月和10月上旬,10月下旬~11月幾乎沒有本地感染病例,而輸入性病例貫穿于整個(gè)流行期。各年齡組和各職業(yè)人群均有發(fā)病。2.2u3000DENV核酸檢測(cè)和序列測(cè)定采用RT-PCR試驗(yàn),選擇42例DENV-NS1抗原陽性患者的血清標(biāo)本進(jìn)行DENV核酸檢測(cè),結(jié)果陽性17例,經(jīng)序列測(cè)定獲得這17例患者標(biāo)本的DENV-C/PreM區(qū)基因核苷酸序列。17例患者中,本地感染病例16例,輸入性病例1例;瑞麗市城區(qū)10例,勐卯鎮(zhèn)5例,姐告鎮(zhèn)2例,均為發(fā)生本地流行地區(qū)的病例;9月13例,10月4例,均為發(fā)病高峰時(shí)期的病例(表2)。2.3u3000DENV-C/PrM區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化分析u3000從瑞麗市2013年DF患者急性期血清中獲得的17株DENV-C/PrM區(qū)基因片段核苷酸序列與來自GenBank中不同國家和地區(qū)的69株DENVⅠ~Ⅳ型代表株相應(yīng)區(qū)段核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖1顯示,瑞麗市17株DENV處在各自獨(dú)立的兩個(gè)分支,其中5株病毒(RLDEN24、RLDEN29、RLDEN31、RLDEN33和RLDEN36)與登革Ⅰ型病毒(DENV-Ⅰ)同在一個(gè)大分支,親緣關(guān)系較為接近,而與登革Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型DENV親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明其屬于DENV-Ⅰ;12株病毒(RLDEN11、RLDEN16、RLDEN18、RLDEN25、RLDEN27、RLDEN28、RLDEN30、RLDEN32、RLDEN35、RLDEN37、RLDEN38和RLDEN42)與登革Ⅱ型病毒(DENV-Ⅱ)同處一個(gè)大分支,而與登革Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型DENV親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明其屬于DENV-Ⅱ(表2、圖1)。根據(jù)圖1中的DENV-Ⅰ進(jìn)化分支分析,瑞麗市2013年DENV-Ⅰ流行株聚集在一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的小分支,它們之間差異較小,為同一個(gè)來源的流行株系。進(jìn)化分析還顯示,瑞麗市這5株DENV-Ⅰ(表2)均與泰國(FJ687432、AY732479和HM769967)、緬甸(AY726553)流行株親緣關(guān)系最近,并與越南(JQ045668和JQ045626)和柬埔寨(GU131923和HM631852)流行株也有較近的親緣關(guān)系,而與印度和美洲地區(qū)流行株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。同樣,麗市2013年DENV-Ⅱ流行株也處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的小分支,它們之間僅有微小差異,同屬一個(gè)流行株系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),瑞麗市12株DENV-Ⅱ(表2)均與越南(JQ045672)和泰國(FJ810412、GU131886和GQ868544)流行株具有較近的親緣關(guān)系,而與巴西、墨西哥和美國等美洲地區(qū)流行株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明,引起本次瑞麗市DF暴發(fā)的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ均來源于東南亞地區(qū)。3denv在調(diào)查過程中的傳播情況東南亞地區(qū)是DF地方性流行地區(qū),全年均有病例發(fā)生,發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)處于較高水平,為全球該病流行最為嚴(yán)重的地區(qū)。瑞麗市為中國云南省中緬邊境地區(qū)的重要沿邊開放城市,邊境線長(zhǎng)168.9km,與緬甸木姐、南坎和九谷市接壤,均為隔江相望,山水相連,自然地理環(huán)境極為相似,中緬兩國在邊境均設(shè)有多個(gè)口岸,其中瑞麗市姐告口岸為我國連接?xùn)|南亞和南亞地區(qū)的重要陸路通道。出入境人員和交通工具流動(dòng)性的增強(qiáng),尤其是兩國邊民的頻繁來往,導(dǎo)致近幾年瑞麗市DF輸入性病例不斷增多,2008年該市曾發(fā)生輸入性DF暴發(fā)并確診49例登革熱。2013年瑞麗市發(fā)生了歷史上最大的一起登革熱流行,在確診的232例登革熱中,緬甸輸入性病例占37.50%,本地感染病例占62.50%。輸入性病例從8月初開始直至11月每個(gè)時(shí)段均有發(fā)生,而本地感染病例于8月末首先出現(xiàn),隨后病例數(shù)快速上升,直至9月下旬開始下降,10月下旬未再發(fā)生新的本地感染病例,本地流行基本得到控制。以往報(bào)道,緬甸存在4個(gè)型DENV的流行,而近幾年則以DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ較為常見。2008年本課題組曾在瑞麗市從來自緬甸木姐市(緊鄰瑞麗的緬甸邊境城市)的輸入性病例中檢測(cè)到DENVⅠ和DENV-Ⅲ,間接證實(shí)了木姐市存在這兩型DENV的流行。本次對(duì)瑞麗市17株DENVu3000C/PrM區(qū)基因核苷酸序列分析表明,導(dǎo)致2013年瑞麗市DF流行的病原主要為DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ,證實(shí)了當(dāng)?shù)赝瑫r(shí)存在這兩型DENV的流行。另外,本次瑞麗市流行的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ分別形成各自相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化支,并緊密地聚集在一起,表明本次同型流行株之間僅存在非常微小的差異,由此認(rèn)為,本次DF疫情的病原無論DENV-Ⅰ或DENV-Ⅱ均為同一來源的同一個(gè)株系。不同地域DENV流行株存在一定差異,分布具有明顯地域性。本次進(jìn)化分析表明,瑞麗市2013年的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ均與泰國、緬甸、越南和柬埔寨等東南亞國家的流行株密切關(guān)聯(lián),由此認(rèn)為,引起本次DF暴發(fā)的病原均來源于東南亞地區(qū)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),瑞麗市2013年所有的DF輸入性病例均來自緬甸,且首例本地感染病例出現(xiàn)之前就有來自緬甸的多例輸入性病例,而9月上旬仍然有較多的輸入性病例進(jìn)入瑞麗,本次還從來自緬甸的1例輸入性病例血清中檢測(cè)到DENVⅠ(RLDEN29)。因此,研究顯示,2013年瑞麗市本地DF流行與來自緬甸的輸入性病例密切相關(guān)。因DF患者在發(fā)病前1d和發(fā)病后5d內(nèi)為病毒血癥期,而輸入性病例在病毒血癥時(shí)期一旦被當(dāng)?shù)孛浇橐廖枚Ｒ?即可感染和傳播DENV。此前調(diào)查證實(shí),白紋伊蚊在瑞麗市廣泛分布,而埃及伊蚊最早于2004年首先發(fā)現(xiàn)于瑞麗市姐告口岸,隨后該市其他地區(qū)以及相鄰的隴川縣和芒市的局部地區(qū)也發(fā)現(xiàn)該蚊。2013年監(jiān)測(cè)表明,該蚊在DF本地流行地區(qū)即瑞麗市城區(qū)及近郊、姐告和勐卯鎮(zhèn)均有分布,而這些包括城區(qū)、城郊及邊境口岸的地區(qū)是相互連接并組成瑞麗市的中心