手針刺激對(duì)大鼠足三里穴區(qū)神經(jīng)束的影響

手針刺激對(duì)大鼠足三里穴區(qū)神經(jīng)束的影響

根據(jù)大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，針灸不僅可以起到鎮(zhèn)痛的作用，還可以調(diào)節(jié)身體和腸道疾病的生理功能來治療。在針刺過程中,神經(jīng)起著不可或缺的作用,其中外周神經(jīng)是針刺即刻有效信號(hào)的重要傳入途徑之一,阻滯針刺穴位神經(jīng)對(duì)針刺的鎮(zhèn)痛效應(yīng)有明顯的抑制作用。此外,我們以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞也參與了針刺鎮(zhèn)痛的過程,如針刺后穴位處肥大細(xì)胞脫顆粒率明顯升高,而通過色甘酸鈉屏蔽肥大細(xì)胞脫顆粒后,針刺鎮(zhèn)痛的作用被削弱。本研究觀察手針刺激大鼠“足三里”穴位后誘發(fā)該神經(jīng)束放電的變化,分析針刺引起的穴位處外周神經(jīng)放電的即刻效應(yīng);同時(shí)觀察運(yùn)用細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉或Ⅰ型膠原酶后,肥大細(xì)胞脫顆粒狀況的改變,以及對(duì)手針誘發(fā)的外周神經(jīng)電信號(hào)變化的影響,從而進(jìn)一步探討針刺效應(yīng)的外周機(jī)制。1材料和方法1.1美國(guó)scxk思想研究傳播成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只,清潔級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,由上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。將大鼠隨機(jī)分為5組:空白組、對(duì)照組、手針足三里組(簡(jiǎn)稱手針組)、手針+色甘酸鈉組、手針+膠原酶組,每組6只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)過上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)討論通過。1.2足三里穴區(qū)被毛空白組:不對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任何處理。手針組:參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位附圖定位,即“足三里”穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5mm處。剪去“足三里”穴區(qū)的被毛,選擇0.35mm×25mm毫針直刺入大鼠左側(cè)“足三里”穴,深度7mm左右,按照1次/s的頻率進(jìn)行提插刺激,提插1min,留針1min,如此反復(fù)交替,持續(xù)20min。對(duì)照組:將毫針直刺入大鼠左側(cè)“足三里”穴,不進(jìn)行任何刺激,留針20min。手針+色甘酸鈉組:在左側(cè)“足三里”穴位注射20μL色甘酸鈉(0.02mg/mL),10min后進(jìn)行手針刺激。手針+膠原酶組:在左側(cè)“足三里”穴位注射20μLⅠ型膠原酶(5μg/mL),30min后進(jìn)行手針刺激。1.3肌肉組織固定大鼠用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉,自主呼吸,體溫用加熱裝置(日本光電,AnimalblanketcontrollerATB-1100)維持在37.5℃左右。當(dāng)大鼠處于完全麻醉狀態(tài)后取俯臥位固定,左后肢股骨內(nèi)側(cè)0.5cm平行股骨方向切開皮膚約3cm,鈍性分離肌肉組織,在股部沿股二頭肌和半膜肌之間的間隙找出坐骨神經(jīng)。用玻璃解剖針輕挑暴露坐骨神經(jīng),并以溫?zé)崾炗捅Ｗo(hù)以備電極記錄。1.4實(shí)驗(yàn)大鼠壓力檢測(cè)外周神經(jīng)電信號(hào):將上述分離的神經(jīng)干置于一雙金屬電極上,神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)經(jīng)電極引入前置放大器(日本DAGAN,EX4-400,高通和低通濾波設(shè)置為10Hz和1000Hz),并輸入多通道生理記錄系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments,PowerLab16/30)。電生理記錄時(shí)采用銅網(wǎng)屏蔽罩以防外界環(huán)境干擾。用Chart軟件(澳大利亞ADInstruments,Version5.3,采樣頻率20k/s)對(duì)神經(jīng)束放電進(jìn)行采樣,記錄手針刺激前30min、手針20min以及停針后30min的電信號(hào)。坐骨神經(jīng)信號(hào)經(jīng)過20Hz數(shù)字濾波處理,進(jìn)行快速傅里葉變換分析。在每分鐘采集的神經(jīng)信號(hào)序列中隨機(jī)抽取6段,每段為6s,包含120000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),并讓它們依次通過Hamming窗口平滑數(shù)據(jù),然后利用Chart軟件中的spectrum模塊計(jì)算出它們的平均序列。各組選取的信號(hào)分別為:(1)空白組,信號(hào)記錄穩(wěn)定15min后,隨機(jī)1min的信號(hào);(2)對(duì)照組,進(jìn)針后,信號(hào)記錄穩(wěn)定5min后,隨機(jī)1min的信號(hào);(3)手針組、手針+色甘酸鈉組、手針+膠原酶組,進(jìn)針提插刺激信號(hào)記錄5min后,隨機(jī)1min提插刺激的即刻信號(hào)。穴區(qū)局部肥大細(xì)胞脫顆粒率:實(shí)驗(yàn)完畢后,各組大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死,取以穴區(qū)為中心體積約為5mm×5mm×5mm的標(biāo)本(包含皮膚及皮下結(jié)締組織),經(jīng)10%福爾馬林固定液固定48h后將組織脫水、石蠟包埋,制作連續(xù)切片(厚約4μm),切片方向?yàn)槠つw縱切面。組織切片采用0.5%甲苯胺藍(lán)染色,常規(guī)脫水、透明后封片。在10×40倍光鏡下對(duì)組織中肥大細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。脫顆粒率=脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)3張切片,取平均值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,通過SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用方差分析,繼以LSD檢驗(yàn)或Dunnett’s(方差不齊)檢驗(yàn),以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1坐骨神經(jīng)活動(dòng)功率譜在同一穴位處,不同的處理因素下,通過手針刺激大鼠“足三里”穴,均可誘發(fā)坐骨神經(jīng)束放電沖動(dòng)(圖1)。經(jīng)過快速傅里葉變換,可以將時(shí)域信號(hào)轉(zhuǎn)換成頻域信號(hào),從而得到手針提插刺激引起的坐骨神經(jīng)活動(dòng)功率譜。手針組、手針+色甘酸鈉組、手針+膠原酶組均可見到3個(gè)明顯的尖峰,且都出現(xiàn)在相同的頻段,即0.92~1.07Hz、1.91~2.06Hz、2.90~3.05Hz(圖2)。每個(gè)尖峰對(duì)應(yīng)著坐骨神經(jīng)信號(hào)在相同頻率的不同能量分布。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,空白組與對(duì)照組相比,坐骨神經(jīng)活動(dòng)功率譜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而手針組的峰值則顯著高于對(duì)照組(P<0.01),提示在手針刺激下,坐骨神經(jīng)活動(dòng)明顯增強(qiáng)。手針+色甘酸鈉組或手針+膠原酶組與手針組比較,各頻率下坐骨神經(jīng)活動(dòng)均明顯減弱(P<0.01),見圖3。2.2肥大細(xì)胞脫顆粒率在光鏡下觀察染色的組織切片,可以看到肥大細(xì)胞由于含有嗜堿性顆粒而呈藍(lán)紫色(圖4A)?？瞻捉M的肥大細(xì)胞脫顆粒率[(47.41±1.30)%]與對(duì)照組[(49.75±2.07)%]相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。手針組的肥大細(xì)胞脫顆粒率[(69.56±4.19)%]明顯高于對(duì)照組(P<0.01),說明手針能刺激肥大細(xì)胞脫顆粒。而預(yù)先注射色甘酸鈉[(45.28±2.56)%]或膠原酶[(41.69±3.44)%]后再進(jìn)行手針的肥大細(xì)胞脫顆粒率明顯低于手針組(P<0.01),與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明色甘酸鈉和Ⅰ型膠原酶均能夠抑制肥大細(xì)胞脫顆粒(圖4B)。3針刺激活穴區(qū)肥大細(xì)胞肥大細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中常見的一種細(xì)胞,廣泛地分布于黏膜下、小血管或淋巴管周圍。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)穴位區(qū)組織的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯多于非穴部位,并有沿經(jīng)或循經(jīng)分布特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,針刺“足三里”穴可促進(jìn)穴位處肥大細(xì)胞脫顆粒;而預(yù)先注射色甘酸鈉或者Ⅰ型膠原酶后,脫顆?，F(xiàn)象明顯減少。色甘酸鈉是一種肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑,可以通過抑制鈣離子內(nèi)流,從而抑制肥大細(xì)胞活化和脫顆粒。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)穴區(qū)肥大細(xì)胞的脫顆粒功能被色甘酸鈉抑制后,針刺“足三里”穴的鎮(zhèn)痛效應(yīng)也相應(yīng)減弱。此外,對(duì)人體結(jié)締組織中膠原纖維的研究表明,膠原纖維主要集中在皮下以及肌間,且多為Ⅰ型膠原。因此,我們選擇Ⅰ型膠原酶用于破壞穴位區(qū)膠原組織的結(jié)構(gòu),同樣發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞脫顆粒也受到了明顯抑制,與之前的研究結(jié)果相似。針刺鎮(zhèn)痛是針刺信號(hào)和痛信號(hào)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互整合的結(jié)果,而外周神經(jīng)是針刺有效信號(hào)的重要傳入途徑之一。如果將軀體傳入神經(jīng)阻斷,針刺對(duì)內(nèi)臟活動(dòng)的影響也隨之消失。研究發(fā)現(xiàn)阻滯針刺穴位或同神經(jīng)干近心端穴位神經(jīng)對(duì)針刺的鎮(zhèn)痛效應(yīng)有明顯的抑制作用,而神經(jīng)阻滯并未對(duì)針刺引起的穴區(qū)肥大細(xì)胞脫顆粒造成明顯影響,說明針刺能激活穴區(qū)的肥大細(xì)胞,但鎮(zhèn)痛信號(hào)由于傳入神經(jīng)被阻滯而無法向上傳遞。還有學(xué)者報(bào)道切斷坐骨神經(jīng)可使針刺“足三里”穴區(qū)引發(fā)的穴區(qū)肥大細(xì)胞聚集和脫顆粒數(shù)明顯減少,表明外周神經(jīng)在針刺穴位肥大細(xì)胞脫顆粒過程中起到非常重要的作用。我們實(shí)驗(yàn)記錄到的坐骨神經(jīng)活動(dòng)情況,反映了支配“足三里”穴位區(qū)的外周神經(jīng)放電變化情況。手針刺激“足三里”穴,在引起肥大細(xì)胞脫顆粒的同時(shí),也誘發(fā)了支配該區(qū)域神經(jīng)動(dòng)作電位的發(fā)放。而當(dāng)屏蔽穴位處肥大細(xì)胞脫顆粒后,手針誘發(fā)的神經(jīng)沖動(dòng)也隨之減弱。由此可見,肥大細(xì)胞在針刺過程中起到了重要的作用。穴位是針刺信號(hào)的起始部位,針刺信號(hào)通過穴位深部的感受器及神經(jīng)末梢的興奮傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。針感的產(chǎn)生可能有兩方面的原因,一是針刺直接機(jī)械作用于神經(jīng)末梢裝置,二是針刺引起穴位組織中化學(xué)成份的改變或組織細(xì)胞顆粒釋放生物活性物質(zhì)作用于神經(jīng)末梢裝置而將針刺刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換為神經(jīng)