促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素免疫陽性神經(jīng)元在大鼠腦內(nèi)的分布

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素免疫陽性神經(jīng)元在大鼠腦內(nèi)的分布

0pvn相關(guān)神經(jīng)原因促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（rch）為41個(gè)善雙。下丘腦室旁核(PVN)小細(xì)胞部的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的CRH,可由垂體門脈系統(tǒng)運(yùn)輸至垂體前葉,與腺垂體促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞膜上的CRH受體結(jié)合,通過增加其細(xì)胞內(nèi)的cAMP與Ca2+,促進(jìn)腺垂體合成和釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)及β-內(nèi)啡肽,當(dāng)血液中促腎上腺皮質(zhì)激素濃度增高時(shí),腎上腺皮質(zhì)就會(huì)釋放皮質(zhì)醇激素(一種糖皮質(zhì)激素),血漿中的ACTH和皮質(zhì)醇水平對(duì)PVN處的CRH具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,生理學(xué)上將該內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)稱為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)。按照抑郁癥發(fā)生的應(yīng)激假說,腦內(nèi)應(yīng)激機(jī)制的過度驅(qū)動(dòng)是導(dǎo)致抑郁癥的重要因素,HPA軸是應(yīng)激反應(yīng)的最后通路,HPA軸失調(diào)是抑郁癥的主要標(biāo)志,PVN處的CRH神經(jīng)元是應(yīng)激反應(yīng)的中樞驅(qū)動(dòng)力。CRH因其可能通過調(diào)節(jié)HPA軸參與應(yīng)激反應(yīng)而受到人們的關(guān)注。CRH神經(jīng)元在PVN的分布早已被人們認(rèn)同,而對(duì)于大鼠腦內(nèi)CRH的分布和特征并未見詳細(xì)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法,利用光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡,研究CRH免疫陽性神經(jīng)元在腦內(nèi)區(qū)域分布的特征,以希為進(jìn)一步研究CRH與應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)性及腦內(nèi)不同區(qū)域在應(yīng)激反應(yīng)中的作用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1動(dòng)物許可證號(hào):scxkSD雄性大鼠,20只,體重250～300g,由安徽省動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK(皖)2005-001)。飼養(yǎng)條件:安靜、室溫20～22℃、自然光照、自由進(jìn)食進(jìn)水。1.2實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.2.1腦冠狀亞胺pfa大鼠腹腔注射麻醉后開胸(7%水合氯醛,10mL/kg),升主動(dòng)脈插管,快速灌注生理鹽水沖洗后,再灌注4%多聚甲醛(PFA)(4℃,pH=7.4),取腦,4%PFA后固定,蔗糖溶液內(nèi)梯度脫水,恒冷冰凍切片機(jī)(LeicaCM1900)連續(xù)冠狀切片,片厚30μm。取PVN,杏仁核區(qū)(AMDY),大腦皮質(zhì)前額葉部(PFC),含運(yùn)動(dòng)皮層、感覺皮層、嗅外側(cè)皮層、梨形皮層互包平面的腦片,直接貼在處理過的玻片上。1.2.2家兔t-42e取要標(biāo)記的冰凍切片,4%PFA補(bǔ)固定10min;0.3%H2O2和1%TrionX100混合液孵育切片30min(避光);5%羊血清封閉30min(37℃);兔抗的CRH血清(Bachem公司,T-4037,12000)孵育60min(37℃)后,4℃孵育12h;生物素化的山羊抗兔IgG(Vector公司,BA-1000,1∶200)孵育60min(37℃),上述各步驟間均用PBS洗3次,每次5min。1.2.3光鏡觀察觀察cy3-dapo采用熒光免疫法標(biāo)記CRH陽性細(xì)胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察CRH在陽性細(xì)胞中的表達(dá)部位,具體步驟如下:取經(jīng)生物素化的山羊抗兔IgG孵育的腦片,Cy3(Invitrogen公司)避光孵育30min,DAPI(Invitrogen公司,D1306,1∶10000)避光孵育30min;甘油緩沖液封片。激光共聚焦顯微鏡觀察拍照(ZeissLSM510,雙光子激發(fā)),激發(fā)波長(zhǎng)為紅光(Cy3)543nm,藍(lán)光(DAPI)800nm。細(xì)胞核為藍(lán)色熒光,CRH在胞漿或軸突表達(dá)顯紅色熒光,在胞核表達(dá)顯紫色熒光。1.2.4dab硫酸鎳銨檢測(cè)采用ABC法標(biāo)記CRH陽性細(xì)胞,具體步驟如下:取經(jīng)生物素化的山羊抗兔IgG孵育的腦片,ABC液(Vector公司,CA94010,1∶200)孵育60min(37℃),DAB硫酸鎳銨加強(qiáng)呈色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。顯微鏡(NikonE800)觀察并拍照,陽性結(jié)果為藍(lán)色反應(yīng)物。1.2.5crh神經(jīng)元的檢測(cè)選取6只大鼠含運(yùn)動(dòng)皮層、感覺皮層、嗅外側(cè)皮層、梨形皮層互包平面相同皮質(zhì)部位的的腦片各3張,在顯微鏡(10×20)下通過Cameralucida將CRH神經(jīng)元描繪于白紙上,層次的邊界通過鄰近的H-E染色切片確定,計(jì)數(shù)每個(gè)層次的陽性細(xì)胞數(shù),壓在右、上線的細(xì)胞計(jì)數(shù),而左、下線的細(xì)胞則不計(jì)。用SPOT軟件,對(duì)總放大倍數(shù)為400倍照片中的陽性神經(jīng)元細(xì)胞體的最大直徑進(jìn)行測(cè)量,每個(gè)區(qū)域測(cè)量3個(gè),取平均值。2結(jié)果2.1雙極神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)通過免疫組織化學(xué)法方法標(biāo)記的CRH神經(jīng)元為非錐體形神經(jīng)元,多為卵圓形或梭形的雙極神經(jīng)元也有少量的多極或假單極神經(jīng),細(xì)胞直徑為10～15μm,胞體著色較深,突起呈念珠狀也著色(圖1a,圖1e)。2.2皮質(zhì)的廣泛區(qū)域CRH神經(jīng)元在PVN(圖1b)、AMDY(圖1c)、PFC(圖1d)、其他皮質(zhì)的廣泛區(qū)域(圖1e)都有分布。其中,CRH神經(jīng)元在PVN和AMD的分布呈簇,在皮層的分布散在,且在Ⅰ～Ⅵ層都有分布,以Ⅱ、Ⅲ層相對(duì)較多,Ⅰ層次之,Ⅳ和Ⅴ層較少,Ⅵ層偶見分布,突起的走向與腦膜垂直。2.3crh在crh免疫反應(yīng)性神經(jīng)元的表達(dá)采用熒光免疫法標(biāo)記的方法,用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核,CRH+Cy3標(biāo)記CRH,通過激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,CRH在CRH免疫反應(yīng)性神經(jīng)元的胞體和突起都有表達(dá),其中在胞體的表達(dá)主要在胞漿(圖2a～圖2c)。3多途徑劑激性md一般認(rèn)為,CRH是PVN分泌的激素,應(yīng)激反應(yīng)中PVN分泌的CRH增多,通過下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸,刺激腎上腺皮質(zhì)合成、分泌以皮質(zhì)醇為中心的糖皮質(zhì)激素(GC),促使機(jī)體各組織發(fā)生應(yīng)激防御反應(yīng)。近年來的研究顯示,應(yīng)激反應(yīng)中腦脊液中的CRH也相應(yīng)增加,CRH廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及體內(nèi)的許多組織內(nèi),不僅可通過內(nèi)分泌系統(tǒng)也可通過植物神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)行為的調(diào)控發(fā)揮其在人體應(yīng)激反應(yīng)中的核心作用,還具有協(xié)調(diào)心血管消化系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)及吸收功能,調(diào)控炎性反應(yīng)的作用,被認(rèn)為可能具有強(qiáng)大的全面調(diào)控人體應(yīng)激反應(yīng)的功能。CRH通過CRH1和CRH2兩種與G蛋白偶聯(lián)的受體發(fā)揮作用,CRH1受體在腦干、皮質(zhì)、杏仁核、垂體前葉和小腦等許多區(qū)域都有分布。CRH通過廣泛分布于中樞的CRH1受體的介導(dǎo)而調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的自主神經(jīng)和情緒行為反應(yīng),CRH分泌增多時(shí)增強(qiáng)了對(duì)CRH1受體的刺激,產(chǎn)生焦慮和抑郁的癥狀,抑制CRH1受體則可以緩解這些癥狀。PFC是所有皮層中功能最復(fù)雜、了解最少的部位,目前普遍認(rèn)為其與意識(shí)、思維、想象、運(yùn)動(dòng)的組織和計(jì)劃、注意等有關(guān)。雖然,前期的研究顯示,PFC與下丘腦之間并沒有直接的神經(jīng)通路,但其與抑郁癥發(fā)病的聯(lián)系早已為人們所關(guān)注,2006年由Barry等提出的抑郁癥的整合情緒記憶模型,從不同方面、不同角度揭示抑郁癥的認(rèn)知機(jī)制,從另一方面表明了PFC與抑郁癥的發(fā)病有著重要的聯(lián)系。AMD與PFC和PVN都有著復(fù)雜的聯(lián)系,AMD不僅參與激活HPA軸的應(yīng)激反應(yīng),對(duì)PFC的活動(dòng)也有激活作用。本實(shí)驗(yàn)中,通過免疫組化方法標(biāo)記的CRH陽性細(xì)胞是一種非錐體形的小細(xì)胞,在胞漿和軸突表達(dá),提示其可能是一種具有分泌功能的神經(jīng)細(xì)胞。在PVN標(biāo)記到了CRH陽性細(xì)胞,提示其在這里有表達(dá),與人們的認(rèn)知吻合。在AMD、PFC及運(yùn)動(dòng)皮層、感覺皮層、嗅外側(cè)皮層和梨形皮層都標(biāo)記到了CRH陽性細(xì)胞,表明其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布的廣泛性。同時(shí)本研究顯示,大腦皮質(zhì)部位CRH細(xì)胞軸突的走向與腦膜垂直,