家畜飼料中添加獸藥的危害

家畜飼料中添加獸藥的危害

1藥物的致死量型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是用放線菌或小單胞菌生產(chǎn)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總稱。它由兩個糖基和一個大環(huán)內(nèi)酯組成，這對革蘭氏陽性和腺體的抑制非常有效。其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌作用相近,按其大環(huán)結(jié)構(gòu)含碳母核的不同,可分為14、15和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近年來,作為動物飼料添加劑的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素已成為世界范圍內(nèi)需求量和銷售速度增長增加最快的抗生素之一,已占世界抗生素市場銷售總值的81.5%。此類抗生素在全球飼料添加劑中的使用量僅次于四環(huán)素類抗生素,我國是世界大環(huán)內(nèi)酯生產(chǎn)第一大國,2002年的產(chǎn)量已達(dá)到72000t,超過世界總產(chǎn)量的2/3。大環(huán)內(nèi)酯可從腸道吸收,能產(chǎn)生交叉抗藥性。自1952年發(fā)現(xiàn)代表品種紅霉素以來已連續(xù)有竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素、羅紅霉素、麥迪霉素、交沙霉素、克拉霉素及它們的衍生物問世,并出現(xiàn)動物專用品種如泰樂菌素、替米考星等。阿維菌素,伊維菌素也屬于大環(huán)內(nèi)酯類,具有廣譜殺寄生蟲作用,并無抗菌活性。屬十四碳大環(huán)的有紅霉素、竹桃霉素;屬十六碳大環(huán)的有泰樂菌素、吉他霉素和螺旋霉素,替米考星是泰樂菌素的半合成化合物,相比于其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有相似或更強(qiáng)的抗菌活性。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為中譜抗生素,起作用均很相似。細(xì)菌對此類抗生素易產(chǎn)生耐藥性。這些殘留的原因主要是不遵守休藥期規(guī)定,未正確使用抗生素,以及飼料和產(chǎn)品在加工、生產(chǎn)過程中受到污染。動物經(jīng)過長期食用后,抗生素及其代謝物在動物的組織及器官內(nèi)蓄積或貯存。藥物在體內(nèi)蓄積達(dá)到一定的濃度,可造成前庭和耳蝸神經(jīng)的損害,導(dǎo)致眩暈和聽力減退。嚴(yán)重者造成肝腎的嚴(yán)重?fù)p害。如不能很好地控制殘留,不但對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅,畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易更是困難重重。因此我國制定了紅霉素,螺旋霉素,替米考星,泰樂菌素等7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的最高殘留量。2大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留分析2.1樣品前處理2.1.1緩沖溶液的配制大環(huán)內(nèi)酯類抗生素呈弱堿性,微溶于水。在水溶液狀態(tài)下一般易被分解,尤其在酸性條件下更不穩(wěn)定。常用的提取試劑Tris緩沖溶液,偏磷酸-甲醇,MCI-Vain-EDTA緩沖溶液,硼酸鹽緩沖溶液,甲醇等。本實驗應(yīng)用上述提取方法萃取肉組織時發(fā)現(xiàn)效率沒有顯著差異。但Tris緩沖溶液不適合提取肝臟,因為提取出的肝紅素干擾實驗操作。偏磷酸-甲醇溶液和其他緩沖溶液需要調(diào)至精確地pH值,提取后還要進(jìn)行過濾等復(fù)雜操作,所需時間較長。通過實驗結(jié)果表明,甲醇適用于多種基質(zhì)中提取大環(huán)內(nèi)酯,而且并能提取出大環(huán)內(nèi)酯的多個組分,易于濃縮,便于以后的凈化處理。2.1.2固相萃取柱的選擇目前生物基質(zhì)的凈化方法主要包括液液萃取、固相萃取,基質(zhì)分散固相萃取、液液萃取結(jié)合固相萃取。對于生物組織樣品脂肪、蛋白等雜質(zhì)是主要的干擾物質(zhì),有效的去除脂肪不但能夠提高方法靈敏度,還能延長儀器和色譜柱的壽命。采用單一的液-液萃取方法處理樣品,檢測結(jié)果背景干擾大、低濃度下回收率低,容易產(chǎn)生假陽性。而SPE既可用于復(fù)雜樣品中微量或痕量目標(biāo)化合物的提取、又可用于凈化、濃縮或富集,是目前獸藥殘留分析樣品前處理中的主流技術(shù)。夏敏采用MCI-Vain-EDTA緩沖溶液提取肉中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,樣品通過預(yù)先用甲醇,水活化后的C18固相萃取柱,再用5ml水洗滌小柱,5ml甲醇洗脫收集,樣品回收率約為50%~60%。Ngoh應(yīng)用C18固相萃取柱富集牛奶中替米考星,樣品回收率達(dá)到97%~101%。Jsokolde等應(yīng)用C18固相萃取柱富集牛奶中的泰樂菌素,加標(biāo)水平在1mg/L和50μg/L時平均回收率分別為94%和89%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4%~7%。MasakazuHorie等采用0.2%偏磷酸-甲醇(6∶4,v/v)提取肉,魚中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,然后通過OASISHLB進(jìn)行凈化:在用甲醇,水活化后,加入樣品,再用水淋洗,最后采用甲醇洗脫,該方法在加標(biāo)0.2μg/g時,樣品回收率為70.14%~93.12%。CarmenLeal等則應(yīng)用BondElutSCX進(jìn)行凈化:采用5ml甲醇和10ml0.1mol/LKH2PO4活化后,放入樣品,10ml水和3ml0.1mol/LK2HPO4淋洗,最后采用甲醇洗脫,該方法樣品回收率為60%~90%。我們評價了OasisHLB和WCX,MCX固相萃取小柱對大環(huán)內(nèi)酯的凈化效果。其中HLB使用了6cc/200mg和6cc/500mg兩種柱子。每種柱子都用6ml甲醇和6ml水活化(WCX用pH=5的水活化),通過加入10ng標(biāo)準(zhǔn)的10ml水,之后用水淋洗,然后用5%甲醇氨洗脫。WCX和MCX對大環(huán)內(nèi)酯凈化濃縮效果不好。6cc/500mg的柱容量大,洗脫時所需溶劑量過大,較難洗脫。而6cc/200mgHLB小柱即可完全吸附提取液中大環(huán)內(nèi)酯,又較容易洗脫。2.2大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留分析方法目前有關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測技術(shù)主要有薄層色譜法(TLC),高效液相色譜(HPLC)法,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法。2.2.1薄層色譜法(TLC)TLC法用薄層板將樣品提取液中被測物展開分離后,測定樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品吸收光或采用發(fā)射光薄層掃描法測定。它設(shè)備簡單,檢驗成本低,操作簡便快速,通過變換不同的顯色劑和檢測方式可用于大量樣品的測定,特別適用于無紫外吸收的雜質(zhì)的檢測。所以,在2000版的《中國藥典》中,所有相關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素物質(zhì)的檢測都使用該法。TLC法也有明顯的缺點(diǎn):分離能力較差,檢測靈敏度較低。2.2.2高效液相色譜(HPLC)法高效液相色譜法(HP-LC)[7,8,9,11,12,13,14,15,16]是目前廣泛應(yīng)用的一種分析方法。多組分分析采用梯度洗脫。使用的檢測器通常為紫外檢測器。目前已成為大多數(shù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的分析方法。Ngoh報道了用液相色譜法測定牛奶中替米考星,樣品離心脫脂,然后通過C18固相萃取柱凈化,用紫外檢測器在280nm檢測牛奶(50~200ng/ml)中替米考星的回收率為97%~101%。Jsokolde等報道了應(yīng)用固相萃取HPLC技術(shù)測定了牛奶中泰樂菌素,采用C18色譜柱分離,用紫外檢測器在287nm檢測樣品,檢測限為10μg/L,加標(biāo)水平在1mg/L和50μg/L時平均回收率分別為94%和89%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4%~7%。高效液相色譜法實現(xiàn)了分離速度快,效率高和操作自動化。但某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在分子中缺乏特征紫外吸收時,如果使用普通的紫外檢測器,由于含量較低,HPLC法將失去靈敏度的優(yōu)勢。2.2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法隨著大氣壓電離(API)技術(shù)的成熟和商品化儀器的普及,LC-MS(MS/MS)已經(jīng)成為食品和環(huán)境中污染物定性、定量分析的重要手段。一般采用電噴霧接口,常壓電離源,正離子方式。Jong-hwanLim等報道了采用LC-MS測定比目魚中羅紅素殘留,在正離子檢測方式下,選擇離子(SIM)為83715m/z,噴霧氣壓是40psi(N2),溫度為350℃,碎裂電壓為100V。LOD為0.01ng/g,LOQ為0.1ng/g。MasakazuHorie等采用LC-ESI-MS測定肉和魚中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留,m/z[M+H]734,688,772,828,728,916分別為EN,OM,KT,JM,MRM,TS的SIM;[M+2H]2+422和435為SPM和TLM的SIM。LOQ為0.01μg/g。MDubois等采用HPLC-MS/MS測定肉、雞蛋和牛奶中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,采用正離子全掃描(fullscanMS)和二級全掃描(fullscanMS2)檢測,離子源溫度為150℃,錐孔電壓為30~50V,碰撞電壓為25~50eV。不同基質(zhì)中LOQ測定為1/2MRL。該方法靈敏度高、選擇性和特異性好,能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn)。但儀器價格昂貴且方法操作復(fù)雜,檢測成本高。另外,目前大多國內(nèi)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法缺乏可靠性和權(quán)威性。3