微生物在農(nóng)藥污染治理中的應(yīng)用

微生物在農(nóng)藥污染治理中的應(yīng)用

中國(guó)是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的主要國(guó)家之一。每年使用的農(nóng)藥量為50.60萬噸。這種植物包括草屑素、殺菌劑、殺菌劑和其他農(nóng)業(yè)化學(xué)品。農(nóng)藥的利用效率很低,其中約80%的農(nóng)藥直接進(jìn)入環(huán)境。由于長(zhǎng)期、大量和不合理的使用,農(nóng)藥在發(fā)揮其保障作物產(chǎn)量巨大功效的同時(shí),也對(duì)環(huán)境造成了污染,嚴(yán)重影響食品安全和人們的身體健康。在農(nóng)藥污染治理方面,微生物因其種類豐富、分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)和代謝途徑多樣的特點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)出自身的優(yōu)勢(shì)。圍繞著農(nóng)藥降解性微生物資源、代謝機(jī)制及農(nóng)藥殘留污染修復(fù),本課題組進(jìn)行了大量的研究工作,形成系統(tǒng)的農(nóng)藥殘留微生物修復(fù)技術(shù)體系,獲得國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)(2005-J-201-2-03-D01)。在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)110周年校慶之際,筆者將近10年來在農(nóng)藥殘留微生物降解方面的工作進(jìn)行綜述以志紀(jì)念。1降解性微生物資源高效降解性微生物是農(nóng)藥殘留微生物修復(fù)技術(shù)的核心,獲得有用的農(nóng)藥微生物降解資源在農(nóng)藥污染治理方面顯得格外重要。由于農(nóng)藥的種類繁多,而微生物的降解一般具有特異性,因此需要針對(duì)不同的農(nóng)藥品種進(jìn)行降解性微生物的分離篩選。近10年來,本實(shí)驗(yàn)室圍繞農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的除草劑、殺蟲劑、殺菌劑及其他有機(jī)污染物,篩選獲得大量的降解性微生物資源(表1),并建立較為全面的降解性微生物菌種資源庫。從降解的目標(biāo)化合物的角度分析,有機(jī)磷殺蟲劑、菊酯類殺蟲劑、磺酰脲類除草劑、對(duì)硝基苯酚降解菌資源較為豐富(圖1)。從降解性微生物的分類地位看,在這些降解菌中,Pseudomonassp.占到了高達(dá)30%的比例,Sphingomonassp.和Paracoccussp.被分離到的機(jī)會(huì)也較多(圖2)。大量的高效降解性微生物資源為污染物的微生物代謝機(jī)制研究及污染土壤的微生物修復(fù)提供了重要的菌種資源。在降解性微生物資源的分離過程中獲得了多株微生物的新菌種,如FlavobacteriumhaoraniiLQY-7、SphingobiumwenxiniaeJZ-1、SphingobiumfaniaeJZ-2、Rhodococcusjialingiaedjl-6-2、LysobacterruisheniiCTN-1、SphingobiumqiguoniiX23,分別用我國(guó)著名的微生物學(xué)家及土壤學(xué)家簡(jiǎn)浩然、陳文新、樊慶笙、王家玲、焦瑞身和趙其國(guó)的名字進(jìn)行了命名。這些新微生物資源的分離為探索微生物多樣性提供了重要的材料。2降解酶基因檢測(cè)在微生物降解農(nóng)藥的代謝途徑中一般有多種降解酶的參與,對(duì)編碼這些降解酶的基因進(jìn)行克隆分析可以幫助闡明微生物對(duì)農(nóng)藥的代謝機(jī)制。本課題組從多株降解性微生物中克隆到一系列的降解酶基因,包括甲基對(duì)硫磷水解酶基因mpd、磺酰脲類除草劑水解酯酶基因sulE、六六六降解基因簇lin、酰胺類除草劑水解酶基因ampA、菊酯類農(nóng)藥水解酶基因pytH及對(duì)硝基苯酚降解基因簇pnp。在降解酶基因克隆過程中,發(fā)展了一種新的染色體步移方法SEFAPCR(self-formedadaptorPCR),可以高效地克隆目標(biāo)序列兩側(cè)的未知序列。2.1水生動(dòng)物聯(lián)絡(luò)導(dǎo)導(dǎo)的pcr擴(kuò)增在克隆降解酶編碼基因的過程中,常常需要對(duì)菌株進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪z傳操作,從保守或已知序列進(jìn)行染色體步移是經(jīng)常采用的方法。Self-formedadaptorPCR(SEFAPCR)是Wang等建立的由已知序列擴(kuò)增未知序列的一種PCR技術(shù)。SEFAPCR是基因組步行PCR設(shè)計(jì)思想的延伸,集連接介導(dǎo)PCR的高特異性和TAILPCR技術(shù)的簡(jiǎn)單性于一身。SEFAPCR在擴(kuò)增中總共用到了4條引物。Sp1、Sp2和Sp4是根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的特異性高退火(如70℃)的引物。Sp3是一條能夠與已知序列部分退火配對(duì)的特殊引物,是整個(gè)SEFAPCR的關(guān)鍵所在。采用SEFAPCR成功地?cái)U(kuò)增了多種植物、真菌、細(xì)菌已知序列的側(cè)翼序列,特別是該P(yáng)CR擴(kuò)增過程具有較高的特異性,且擴(kuò)增的目的條帶比較長(zhǎng)。管莉菠等利用該方法成功地克隆出了PseudomonasputidaGM6菌株的多聚磷酸鹽激酶基因ppk,并對(duì)該基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。李娜等和何健等分別以總DNA為模板,利用該P(yáng)CR方法克隆了靈芝鯊烯合酶基因的啟動(dòng)子序列和中度嗜鹽菌Halomonassp.BYS-1四氫嘧啶合成基因(ectABC)及其上游序列。由于基因組步移技術(shù)在遺傳操作中的重要性,因此SEFAPCR在側(cè)翼序列克隆領(lǐng)域?qū)?huì)得到更加廣泛的利用。2.2pnp基因序列分析崔中利等分離到了1株甲基對(duì)硫磷降解菌Plesiomonassp.M6,該菌具有有機(jī)磷水解酶活性,可水解甲基對(duì)硫磷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP),這與Rani等研究的甲基對(duì)硫磷降解途徑一致,但M6卻不能將對(duì)硝基苯酚進(jìn)一步降解。通過鳥槍法從菌株M6基因組文庫中篩選到該水解酶基因,并將其命名為mpd。該基因與已報(bào)道的編碼甲基對(duì)硫磷水解酶的基因opd完全不同,序列比對(duì)結(jié)果也表明,mpd基因序列與opd基因無同源性。PseudomonasputidaDLL-E4可以進(jìn)一步降解甲基對(duì)硫磷分解產(chǎn)生的PNP。Shen等通過SEFAPCR擴(kuò)增DLL-E41,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶(PnpC)基因的側(cè)翼序列,獲得12kb的DNA片段。序列分析發(fā)現(xiàn)該片段中含有10個(gè)參與對(duì)硝基苯酚代謝的開放閱讀框架(圖3),并將其命名為pnp基因簇。在該基因簇中,pnpA編碼的是一個(gè)依賴FAD和NADH的單組分對(duì)硝基苯酚4-單加氧酶PnpA,在NADH和FAD存在的情況下,將對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為對(duì)苯醌(p-benzoquinone)。pnpC編碼的是1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶,可將1,2,4-苯三酚轉(zhuǎn)化為馬來酰乙酸。pnpC1C2編碼的PnpC1C2是對(duì)苯二酚(HQ)雙加氧酶(PnpC1C2)多組分蛋白復(fù)合體,催化對(duì)苯二酚生成4-羥基黏糠酸半醛。pnpR是lysR家族調(diào)節(jié)基因,在pnp基因簇中,pnpR是一個(gè)參與對(duì)苯二酚降解的正向調(diào)控子。劉衛(wèi)東對(duì)1,2,4-苯三酚(BT)1,2-雙加氧酶(PnpC)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究。發(fā)現(xiàn)PnpC由6個(gè)較長(zhǎng)α螺旋和7個(gè)β折疊及轉(zhuǎn)角組成。氨基酸截短試驗(yàn)說明,PnpCN端起始的3個(gè)α螺旋區(qū)對(duì)PnpC的酶活力是必需的。2.3不同結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新基因磺酰脲類除草劑是一類超高效除草劑,使用量低,但其殘留造成的危害較為嚴(yán)重。Hang等研究了HansschlegeliazhihuaiaeS113對(duì)磺酰脲類除草劑的降解,發(fā)現(xiàn)這一家族的除草劑可以通過去酯化轉(zhuǎn)化成無除草活性的相應(yīng)的酸,這與Lu等的研究結(jié)果一致,并從S113中克隆到了1個(gè)與磺酰脲類除草劑去酯化代謝有關(guān)的酯酶基因sulE。通過對(duì)SulE基因測(cè)序及其表達(dá)蛋白SulE氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),該基因含有1194個(gè)堿基,G+C摩爾分?jǐn)?shù)為51.09%,編碼398個(gè)氨基酸。SulE含有信號(hào)肽序列,切割位點(diǎn)在第37位的Ala和第38位的Glu之間,SulE是一個(gè)同源二聚體,每個(gè)亞基相對(duì)分子質(zhì)量為41×103,等電點(diǎn)(pI)為8.3。SulE含有α/β水解酶的保守結(jié)構(gòu)域,屬于α/β水解酶超家族。SulE具有α/β水解酶家族蛋白典型三聯(lián)體催化活性位點(diǎn)SerHis-Glu(Ser245、His369和Glu28);但是在催化位點(diǎn)的Ser周圍沒有該家族特征序列(Gly-X1-Ser-X2-Gly);因此,初步確定SulE是α/β水解酶家族的一個(gè)新成員。氯乙酰胺類除草劑是目前除草劑中用量排行第3的除草劑,其主力品種包括乙草胺、丁草胺等,其微生物降解也受到關(guān)注。Paracoccus屬的微生物對(duì)酰胺類除草劑具有較好的降解能力。Zhang等從Paracoccussp.FLN-7中克隆到1個(gè)編碼酰胺水解酶的基因ampA。AmpA可以水解酰胺類除草劑敵稗,并可以作用于多種酰胺類化合物及含酰胺鍵的有機(jī)磷農(nóng)藥。該酶的氨基酸序列與已知酰胺酶的一致性較低(小于22%),但其活性中心的結(jié)構(gòu)卻與其他酰胺酶一樣是保守的(Ser154-Ser178-Lys79)。AmpA結(jié)構(gòu)特性及其廣泛的底物范圍使得它在轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物育種方面具有巨大的應(yīng)用潛力。2.4lin2結(jié)構(gòu)及功能基因的擴(kuò)增馬愛芝等從長(zhǎng)期受六六六污染的土壤中分離得到1株能以HCH為唯一碳源的高效降解菌株Sphingomonassp.BHC-A。BHC-A菌株在12h以內(nèi)能夠完全礦化質(zhì)量濃度均為5mg·L-1的α-、β-、γ-、δ-HCH4種異構(gòu)體,特別是對(duì)β-HCH的降解在國(guó)際上也屬少例。Wu等以菌株Sphingomonassp.BHC-A為材料,通過Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變法,篩選到1株完全喪失β-HCH降解功能的菌株。通過構(gòu)建BHC-A45的基因組文庫,篩選到1株含有Tn5轉(zhuǎn)座子序列的陽性克隆,對(duì)陽性克隆的轉(zhuǎn)座子側(cè)翼進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了1個(gè)鹵代烷烴脫鹵酶基因linB2。與S.paucimobilisUT26脫鹵酶LinB一樣,LinB2可將β-HCH轉(zhuǎn)化為β-2,3,4,5,6-五氯環(huán)己醇(β-PCHL),不同的是,LinB2還可將β-PCHL繼續(xù)降解為β-2,3,5,6-四氯1,4-環(huán)己二醇(β-TDOL)。LinB是一個(gè)α/β水解酶家族中的氯代烷烴脫氯酶,與來源于XanthobacterautotrophicusGJ10的鹵代烷烴脫鹵酶(DhlA)、Moraxellasp.B的鹵代乙酸脫鹵酶(DehH1)及Pseudomonassp.CF600的2-羥基黏糠酸半醛水解酶(DmpD)具有顯著相似性。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,LinB2的氨基酸序列與S.japonicumUT26LinB具有97%的同源性。LinB2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,在類似連接酶區(qū)域具有與LinB相同的催化位點(diǎn)(Asp-108、His-272和Glu-132);同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在LinB和LinB2的相同氨基酸位點(diǎn)處有7個(gè)氨基酸殘基不同。在LinB中為Ala-81、Ala-112、Ile-134、Ala-135、Ile-138、Ala-247和Met-253,而在LinB2中為Thr-81、Val-112、Val-134、Thr-135、Leu-138、His-247和Ile-253。通過對(duì)這7個(gè)氨基酸中的每個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變分析,結(jié)果表明每個(gè)氨基酸的改變都會(huì)明顯減弱LinB2β-HCH和β-PCHL降解活性,氨基酸突變數(shù)目越多,減弱效果越明顯,而當(dāng)這個(gè)7個(gè)氨基酸完全突變時(shí),LinB2已經(jīng)完全喪失了β-HCH和β-PCHL降解活性;因此,推測(cè)這7個(gè)氨基酸殘基差異可能是導(dǎo)致LinB無LinB2β-PCHL降解活性的原因。2.5ctn水降解氯酶Liang等從長(zhǎng)期施用百菌清的土壤中分離到1株高效降解百菌清的Ochrobactrumsp.CTN-11,該菌可在無其他碳源的情況下,48h內(nèi)可將50mg·L-1的百菌清完全降解。與以前報(bào)道的百菌清高效降解菌TB1相比,菌株CTN-11的降解效率明顯高于TB1。菌株TB1需在其他碳源存在的情況下,于120h內(nèi)將30mg·L-1的百菌清完全降解。對(duì)菌株CTN-11來說,添加碳源可增強(qiáng)降解,但并不是降解所必需的。研究表明,菌株CTN-11可通過水解脫氯將CTN降解為對(duì)魚類和無脊椎動(dòng)物微毒的羥基百菌清(CTN-OH),但CTN-OH卻不能被進(jìn)一步降解。為了進(jìn)一步研究CTN水解脫氯的代謝過程,Wang等分離到了另1個(gè)CTN降解菌Pseudomonassp.CTN-3,該菌株具有水解脫氯酶活性。從CTN-3中克隆到1個(gè)編碼CTN水解脫氯酶的基因chd,與目前報(bào)道的唯一一個(gè)水解脫氯酶(4-氯-輔酶A脫鹵酶)代謝途徑顯著不同。在厭氧和有氧條件下,該酶均可進(jìn)行水解脫氯反應(yīng),并且不需要輔因子如輔酶A和ATP的存在。該研究為鹵化芳香族化合物水解脫鹵機(jī)制的研究提供了一個(gè)更好的脫氯酶。2.6擬除蟲菊酯農(nóng)藥擬除蟲菊酯是一類重要的殺蟲劑,這一家族的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其微生物降解受到關(guān)注。Wang等分離到1株Sphingobiumsp.JZ-1菌株,JZ-1可以通過水解作用降解多種擬除蟲菊酯農(nóng)藥。從JZ-1中克隆到1個(gè)羧酸酯酶基因pytH,該基因編碼1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量31×103的菊酯水解羧酸酯酶(PytH),與已發(fā)現(xiàn)的菊酯水解酶沒有任何同源性,與α/β折疊水解酶家族的同源性為20%左右,顯示PytH是一個(gè)新的農(nóng)藥水解酶。3污染物降解中中間代謝產(chǎn)物的檢測(cè)微生物通過一系列的生理生化過程來分解農(nóng)藥等污染物,通過中間代謝產(chǎn)物的分析可以重構(gòu)微生物的降解代謝途徑?，F(xiàn)代儀器分析手段的引入,如GC-MS、LC-MS以及核磁共振等技術(shù),可以有效地檢測(cè)污染物降解過程中的中間代謝產(chǎn)物。目前,很多降解微生物的代謝途徑已被發(fā)現(xiàn),微生物降解轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)庫(biocatalyst/biotransformationdatabase,UM-BBD)收錄了超過200種污染物的降解代謝途徑。我們?cè)谝阎到馕⑸锎x途徑的基礎(chǔ)上分別對(duì)氯乙酰胺類除草劑、菊酯殺蟲劑、百菌清殺菌劑的降解代謝途徑做了一系列深入的研究,使人們更加詳細(xì)地了解微生物對(duì)農(nóng)藥的降解并為農(nóng)藥的環(huán)境修復(fù)提供了基礎(chǔ)。3.1氯乙酰胺類從碳源生長(zhǎng)規(guī)律分析氯乙酰胺類除草劑是酰胺類除草劑的重要成員,Zhang等從水稻土中分離到1株氯乙酰胺類除草劑高效降解菌Paracoccussp.FLY-8。菌株FLY-8可降解并利用6種氯乙酰胺類除草劑作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng),降解率從大到小依次為甲草胺、乙草胺、異丙草胺、丁草胺、丙草胺、異丙甲草胺。分析了氯乙酰胺類除草劑的分子結(jié)構(gòu)對(duì)降解率的影響,發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈烷基越長(zhǎng),降解效率越低。在FLY-8降解過程中檢測(cè)到了甲草胺、2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)乙酰胺及2,6-二乙基苯胺等中間代謝產(chǎn)物。由于FLY-8能夠利用苯胺進(jìn)行生長(zhǎng),推測(cè)丁草胺是通過圖4中的降解代謝途徑實(shí)現(xiàn)完全礦化。該研究為菌株FLY-8在氯乙酰胺類除草劑及含有該類除草劑環(huán)境的原位生物修復(fù)的使用提供了重要的潛在可能性。3.2-苯氧基苯甲醛和3-四甲基環(huán)丙酸酯Guo等從擬除蟲菊酯生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離到1株廣譜的菊酯降解菌SphingobiumfaniaeJZ-2,可降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯。菌株JZ-2具有菊酯水解酶活性,通過酯鍵斷裂降解甲氰菊酯,生成3-苯氧基苯甲醛和2,2,3,3-四甲基環(huán)丙酸(圖5)。3-苯氧基苯甲醛、3-苯氧基苯甲酸、原兒茶酸鈉和鄰苯二酚是甲氰菊酯降解的中間產(chǎn)物。3-苯氧基苯甲酸和鄰苯二酚通過鄰位裂解途徑被進(jìn)一步氧化。3.3-pnpa和4-苯三酚的分離和代謝硝基酚類化合物是重要的環(huán)境污染物,其中的4-硝基苯酚(PNP)被列為優(yōu)先控制污染物。根據(jù)PseudomonasputidaDLL-E4對(duì)硝基苯酚降解過程中關(guān)鍵酶的功能及代謝中間產(chǎn)物分析,我們建立了P.putida中硝基酚類化合物的代謝途徑。假單胞菌DLL-E4通過PNP-4-單加氧酶PnpA將PNP轉(zhuǎn)化為對(duì)苯二酚(HQ),在HQ雙加氧酶的作用下進(jìn)行開環(huán),并在一系列酶的作用下轉(zhuǎn)化成β-酮己二酸,進(jìn)入到三羧酸循環(huán)(TCA)。DLL-E4可以PNP為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng),但不能降解其類似物4-硝基鄰苯二酚(4-NC)。當(dāng)同時(shí)存在對(duì)硝基苯酚和4-硝基兒茶酚時(shí),則二者均可以被利用。功能分析表明PnpA可以作用于PNP和4-NC,但4-NC單獨(dú)不能誘導(dǎo)PnpA的表達(dá),因此菌不能利用4-NC為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。4-NC轉(zhuǎn)化生成的1,2,4-苯三酚(BT)可以被PnpC開環(huán),進(jìn)入到HQ的代謝途徑中。通過對(duì)pnp基因簇功能驗(yàn)證結(jié)合質(zhì)譜分析,我們認(rèn)為該基因簇編碼了2個(gè)硝基苯酚類化合物代謝途徑:PNP降解的對(duì)苯二酚途徑和4-NC降解的偏三苯酚途徑(圖6),不同于現(xiàn)在已報(bào)道的來源于其他微生物的PNP代謝途徑。4微生物殘留降解研究表明,農(nóng)藥噴施到田間后,其殘留會(huì)造成嚴(yán)重的農(nóng)田環(huán)境面源污染,造成農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降,進(jìn)而影響人類的身體健康。生物修復(fù)是一種低成本的環(huán)境友好型面源污染修復(fù)技術(shù)。大量的研究結(jié)果顯示農(nóng)藥降解菌在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下可以高效地降解化學(xué)農(nóng)藥。因此,研究降解菌在田間條件下對(duì)農(nóng)藥殘留的降解,可以為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)。張瑞福等和蔣建東等以韭菜中的農(nóng)藥為對(duì)象,研究了微生物降解技術(shù)在農(nóng)藥殘留降解方面的重要作用。研究發(fā)現(xiàn),施用高效農(nóng)藥殘留降解菌劑能顯著降低韭菜中農(nóng)藥殘留的含量;在一定范圍內(nèi),降解率隨著菌劑用量的增加而升高,同時(shí)控制降解菌使用時(shí)間不會(huì)對(duì)蟲害的防治產(chǎn)生不利的影響。Huang等將Pseudomonassp.IM-4接種至咪草煙處理過的滅菌土壤,與未接菌相比,咪草煙的降解率提高5倍;將IM-4接種至咪草煙處理過未滅菌土壤,與對(duì)照相比,咪草煙降解率提高3倍,并發(fā)現(xiàn)菌株IM-4可減緩咪草煙對(duì)玉米的毒害作用。這些研究為無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新的思路。施用到土壤中的降解性微生物與土著微生