幾種檢測纖維素的方法比較

幾種檢測纖維素的方法比較

關于木霉等低質量細菌纖維素酶的研究報道很多。已經報告的纖維素酶的測定方法也很多，包括棉線法、濾紙?zhí)?、cmc-t閾值降低法、染色纖維法、平板法和羧甲基纖維鈉酶活性法。對具有較強對維生素分解能力的微生物（如細菌）的酶活性、酶活性和活性機制的研究較少，因此這些規(guī)則不適用于其他低質量的微生物。但目前對于這些方法測定的具體數(shù)值的可信度、可比性，卻沒有相關的報道研究。本次實驗對報道較多的4種方法進行實驗，研究這些實驗方法的穩(wěn)定性，從而為實驗研究提供一定的參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1光光度計和工物用量HH-6型恒溫水浴鍋;22PC型分光光度計;HG1001型電熱鼓風干燥箱;FA2004型電子分析天平;UV-2401型紫外雙光束分光光度計1.2實驗方法1.2.1試劑的制備1.2.1.l冰醋酸鈉溶液6醋酸-醋酸鈉緩沖液：11.8mL冰醋酸定容至100mL，稱取27.2g的醋酸鈉溶解并定容至100mL，將上述兩種溶液等體積混合。1.2.1.結晶酚溶液的配制稱取3,5-二硝基水楊酸6.3g于500mL大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加入到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。1.2.1.3-3c-na溶液稱取0.625g羧甲基纖維素鈉，加熱溶解，定容至100mL。1.2.2酶活性測定1.2.2.葡糖糖的制備原理：3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量和反應液的強度成比例關系，利用分光光度計測出其在520nm處的吸光度，得出還原糖的量。葡萄糖標準溶液的配制：將葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，稱取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100mL。取16支具塞試管，依次編號為0,1,2,3,4,5,6,7并作平行實驗。由于各種方法反應體系的總體積不同，所以需作不同的標準曲線，所加的量也有所不同?，F(xiàn)以總體積為9mL體系為例：搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25mL。搖勻后以0號管為對照于最大吸收波長處測定OD值，以葡萄糖含量μmol為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。1.2.2.維素酶液的配制配制不同濃度的標準酶液：用去離子水100mL來溶解100mg纖維素酶（≥1000IU），配制成1mg/mL酶液。測定時分別吸取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL上述酶液用水補足至1mL，即為不同濃度的酶液。1.2.2.葡萄糖mol數(shù)的檢測濾紙是聚合度和結晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法，此方法應用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活(FilterPaperActivity,FPA)。方法：取1mL酶液加1mL0.1mol·L-1、pH4.6的醋酸緩沖液，預熱到50℃，加入1條1×6cm新華濾紙(50±1mg)，50℃保溫1h。取出，沸水浴滅活5min，冷卻至室溫，用3mLDNS試劑顯色后稀釋3倍，測OD值(520nm)。OD值越大，說明該菌株的酶活力越強。酶活力計算：從標準曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；其中：60為保溫時間(酶與底物作用時間，min)；Ew為粗酶液的體積(mL)；u是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.粗酶活力測定原理：纖維素酶對CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用標準葡萄糖溶液作標準液，22PC分光光度計在520nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當于1μmol的葡萄糖為一個酶活性單位。取3支帶有20mL刻度的試管，1支管作空白對照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1mL酶溶液，置于50℃水浴鍋中預熱2min，然后在3支試管中分別加入4mL已預熱至50℃的底物溶液，準確計時5min取出，每管立即分別加入1mL2mol/L氫氧化鈉溶液和2mLDNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1mL酶液。將3支試管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20mL，于520nm處測OD值。酶活力計算：從標準曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；其中：5為保溫時間(酶與底物作用時間，min)；Ew為粗酶液的體積(mL)；u是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.吸光度的測定用考馬斯亮藍使濾紙染色酶解后在最大吸收波長處測釋放的著色物的吸光值，代表酶活，以吸光度為縱坐標，酶濃度為橫坐標做曲線。在實際測定時，先利用紫外雙光束分光光度計進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在536nm處吸收峰最高，因此在實驗時以此波長作為測定波長。1.2.2.底物粘度測定底物溶液9mL，加酶液1mL,40℃，測定底物粘度減至一半時所需時間，以奧氏粘度計測定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作為一個單位。2結果與分析2.1葡糖糖的測定實驗中所用的標準葡萄糖曲線繪制結果如下：由于在以后的測定中，各方法的反應體系并不相同，所以每個體系須有各自的葡糖糖標準曲線作為今后的參照。CMC糖化力測定參照圖1，有三條曲線，是因為在常用測定中酶與底物不同，而造成它們各自體系的溶液的總體積也不相同，因此此方法的葡萄糖標準曲線有三條。濾紙法參照圖2。所得三條曲線的回歸方程如下：所得曲線的回歸方程：2.2實驗結果的比較酶活測定方法結果比較如下：所得曲線的回歸方程：所得曲線的回歸方程：實驗結果表明：用標準纖維素酶所做的CMC酶活測定和濾紙酶活測定，從回歸曲線可以看出他們的線性較好，可以充分說明這2種方法比較穩(wěn)定。而且CMC酶活測定法和濾紙酶活測定法在很多報道中均在采用，這樣使實際實驗的結果更具可比性。所得曲線的回歸方程：所得曲線的回歸方程：由上述結果可知：CMC粘度降低法的線性沒有濾紙酶活測定法和CMC酶活測定法來得好，而且在實驗過程中，兩個平行實驗之間有較大的誤差。但從回歸方程就能看出，該方法的穩(wěn)定性較其他3種方法有很大的偏差。3測定方法的比較本次實