改良arlov評分及he染色組織學(xué)評價半橫斷性脊髓損傷模型

改良arlov評分及he染色組織學(xué)評價半橫斷性脊髓損傷模型

脊柱損傷（cp）是一種嚴(yán)重的疾病。中國每年有大量患者因暑假而出現(xiàn)嚴(yán)重的癱瘓和癱瘓。SCI后神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維如何再生及能在多大程度恢復(fù)功能等均是很關(guān)鍵的問題。近年來,人們?yōu)樘接懠顾钃p傷修復(fù)的機理進行了大量的實驗研究。但到目前為止,在不同類動物實驗中評價脊髓損傷往往存在很大差異,還沒有一種與人類最為接近的理想脊髓損傷模型,為了提高實驗的運用價值,我們用較接近人的非人靈長類動物恒河猴為實驗動物,建立了成年恒河猴脊髓半橫斷模型以探討脊髓損傷修復(fù)及再生機理,為今后臨床應(yīng)用提供一定的理論實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物分組成年恒河猴8只,雌雄不限,年齡約兩歲,體質(zhì)量3.5～4.5kg(昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供),隨機分為假手術(shù)和脊髓半橫斷組兩組,每組各4只。1.2椎旁肌研磨法氯胺酮(50mg/kg)復(fù)合安定(1.5mg/kg)肌肉注射麻醉動物,俯臥位固定,常規(guī)備皮,消毒鋪巾,以T10棘突為中心取后正中切口,長約5cm,逐層切開背部皮膚、皮下組織、胸背筋膜,切開椎旁肌棘突附著處,Cobb剝離器于椎板骨膜下剝離椎旁肌至關(guān)節(jié)突部,干紗布填塞止血。自動撐開器牽開椎旁肌,清理椎板及棘突旁殘余的軟組織,切開T10棘上韌帶及棘間韌帶,剪除T10棘突及切開黃韌帶,Kerrison鉗咬開椎板,暴露脊髓。切開硬脊膜及蛛網(wǎng)膜,術(shù)中可見腦脊液流出及脊髓正常搏動,以脊髓后正中血管為標(biāo)志,鋒利尖刀片自脊髓后正中裂迅速輕劃至脊髓左側(cè),劃開軟脊膜及部分脊髓組織。以同樣方法依次分層切割,并切除1mm長左半脊髓,術(shù)畢間斷縫合硬脊膜,分層縫合肌層與皮膚;假手術(shù)組同樣切開椎板,但不打開硬脊膜。術(shù)后予青霉素鈉80×104U靜脈輸液防治感染,加強管理及防治并發(fā)癥。1.3石蠟包埋前角神經(jīng)元的檢測術(shù)后3月時,取兩組試驗猴,經(jīng)左心室插管至主動脈,剪開右心耳,灌注生理鹽水1000ml沖洗血液,再灌注1000mlZamboni液固定,取T12脊髓標(biāo)本取材后固定1月,石蠟包埋水平切片,切片厚度為6μm,行HE染色、橫切面通過細(xì)胞核為標(biāo)準(zhǔn),計數(shù)脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元。1.4神經(jīng)功能的檢測1.4.1行為觀察觀察術(shù)后24h、1月、2月、3月,后肢自主運動、肌力和肌張力改變。依據(jù)文獻對肌力進行評分。1.4.2電極刺激試驗采用丹麥DANTAC公司生產(chǎn)CantataTM體感誘發(fā)電位儀,按國際腦電圖制定的系統(tǒng),仿人體部位設(shè)置針記錄電極和參考電極,極間阻抗<2KΩ。表面電極置于內(nèi)踝刺激脛后神經(jīng),記錄電極置于Cz(中央后回的電生理體表定位區(qū)),參考電極置于Fp(前額電生理體表定位區(qū))處,刺激強度10mA,頻率3Hz,疊加500次,基本波形為P1-N1-P2波,待波形穩(wěn)定且重復(fù)3次時中止并描記結(jié)果。假手術(shù)組和脊髓半橫斷組每只猴分別于術(shù)后24h及3月進行測定,主要觀察P1潛伏期和P1-N1波幅變化。1.5統(tǒng)計方法對各組脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元數(shù)進t檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2皮質(zhì)體感誘發(fā)電位csep變化2.1形態(tài)學(xué)觀察脊髓半橫斷組脊髓損傷處結(jié)締組織增生與周圍硬脊膜粘連,半橫斷切口處略向外膨出,對合不整齊,形成不規(guī)則的空腔,內(nèi)有少許組織充填。脊髓損傷下位節(jié)段灰質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞增多,半橫斷同側(cè)灰質(zhì)前角神經(jīng)元數(shù)量(31.25±3.6)與半橫斷對側(cè)前角神經(jīng)元數(shù)目(68.74±2.8)相比明顯減少(P<0.01)、細(xì)胞固縮,白質(zhì)前、側(cè)及后索有散在空洞形成(附圖),假手術(shù)組灰質(zhì)前角種經(jīng)元數(shù)為71.35±3.62。2.2行為學(xué)觀察傷后24h,假手術(shù)組雙后肢肌力均為3級,脊髓半橫斷組左側(cè)后肢為0級,肌張力下降,表現(xiàn)為遲緩性癱,右側(cè)為3級;傷后3d,假手術(shù)組雙后肢肌力均恢復(fù)正常;傷后5～7d脊髓半橫斷對側(cè)后肢恢復(fù)正常,能負(fù)重;傷后14d,半橫斷側(cè)后肢肌容積減少,表現(xiàn)為左后肢痙攣性癱,傷后一月,脊髓半橫斷同側(cè)后肢肌力均為二級;傷后三月內(nèi),其中有兩只左后肢為3級,其余均為4級且有主動握持及部分負(fù)重(附表)。2.2皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)變化CSEP主要由后索傳導(dǎo),是檢測感覺傳導(dǎo)通路的客觀、敏感指標(biāo),猴CSEP包括3個基本可辨認(rèn)波,系列為P1-N1-P2,傷側(cè)P1潛伏期為(32.9±10.43)ms,較對側(cè)(19.7±1.89)ms明顯延長。傷側(cè)P1-N1波幅為(3.43±1.46)μυ比對側(cè)(6.97±2.82)μυ明顯減低。3討論3.1損傷區(qū)神經(jīng)元的恢復(fù)脊髓半橫斷后3個月,損傷處結(jié)締組織增生與周圍硬脊膜粘連,半橫斷處脊髓吻合較差,雖有少許組織充填,但仍形成不規(guī)則空腔,說明斷端缺少支持物恢復(fù)其形態(tài)的連續(xù)性,由于成年哺乳動物的再生神經(jīng)纖維難以逾越損傷造成的膠質(zhì)瘢痕和液化壞死空洞,因此,必須借助于其他手段橋接誘導(dǎo)再生纖維通過損傷區(qū),恢復(fù)已遭破壞的神經(jīng)聯(lián)系。形態(tài)學(xué)觀察顯示,脊髓損傷部位神經(jīng)元數(shù)量較對側(cè)明顯減少,膠質(zhì)細(xì)胞增多,說明存在損傷區(qū)神經(jīng)元的丟失,可能由于神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌不足以及脊髓損傷后啟動一系列自殺性瀑布反應(yīng)所致。脊髓前角神經(jīng)元固縮,且有散在空洞形成,為脊髓損傷后各種病理反應(yīng)的組織學(xué)表現(xiàn)。3.2術(shù)后運動功能本研究通過切斷成年恒河猴左側(cè)T11脊髓觀察后肢功能改變,術(shù)后左后肢運動功能完全喪失,14天可有部分恢復(fù),2至3個月?lián)p傷側(cè)肌力評分達(dá)最大值,且有主動握持及部分負(fù)重,脊髓半橫斷側(cè)皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)結(jié)果顯示P1潛伏期延長,P1-N1波幅明顯降低,為感覺傳導(dǎo)通路受損的表現(xiàn),國內(nèi)孟曉梅等的研究表明,成年猴脊髓半切后體感誘發(fā)電位變化與后肢運動功能密切相關(guān),為脊髓損傷后后肢運動功能的一項間接、客觀的檢測指標(biāo)。機體對運動的正常控制體現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)不同水平之間精細(xì)和動態(tài)的平衡,脊髓嚴(yán)重或完全損傷后,很多動物在脊髓損傷以下節(jié)段可以重新出現(xiàn)后肢運動,損傷后脊髓逐漸最終部分獲得對運動控制的能力,這些研究提示運動控制的可塑性,可能是由于損傷部位以下脊髓內(nèi)固有神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)所致運動功能重建。此外,許多學(xué)者也認(rèn)為,半橫斷對側(cè)脊髓側(cè)枝出芽也可能是促進神經(jīng)功能可塑性的重要因素,即脊髓損傷后存在一定的自我修復(fù)能力。我們采用后入路急性脊髓半橫斷模型,用半橫斷側(cè)與對側(cè)進行比較,并選擇種屬較接近人類的恒河猴為實驗動物,采用銳性分層切割的方法,以減少術(shù)中對脊髓的擠壓,術(shù)后觀察后肢神經(jīng)功能的變化,建立了穩(wěn)定、可重復(fù)的非人靈長類恒河猴脊髓半橫斷模型,所需裝置簡單、手術(shù)操