枳實(shí)總黃酮提取物對(duì)柚皮苷-新橙皮苷-新橙皮苷藥代動(dòng)力學(xué)研究

枳實(shí)總黃酮提取物對(duì)柚皮苷-新橙皮苷-新橙皮苷藥代動(dòng)力學(xué)研究

功能障礙（fd）是一種常見的功能胃腸病。臨床表現(xiàn)為晚餐后飽脹不適、早飽、上腹痛和上腹燒灼感，無(wú)可能解釋上述癥狀的器官疾病的證據(jù)。奧蘭替胃康片由枳實(shí)經(jīng)提取有效成分枳實(shí)總黃酮苷提取物制成,總黃酮含量達(dá)90%～95%,其中柚皮苷、新橙皮苷各占30%～40%。枳實(shí)性味苦、辛,微寒,歸脾胃大腸經(jīng),具有破氣消積、化痰除痞的功效。臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)奧蘭替胃康片可用于FD的治療。柚皮苷是柚皮素-7-O-鼠李糖基葡萄糖苷(4′,5,7-trihydroxy-flavanone-7-rhamnoglucoside),新橙皮苷為橙皮素-7-O-鼠李糖基葡萄糖苷(3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavanone-7-rhamnoglucoside)(圖1),是一種雙氫黃酮類化合物。研究表明,柚皮苷及新橙皮苷在抗病毒、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、脫敏、抗過(guò)敏、活血解痙、改善局部微循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)供給等方面具有較強(qiáng)的生物活性。此外,柚皮苷通過(guò)和腸內(nèi)P-糖蛋白交互作用影響藥物的吸收,同時(shí)也能影響細(xì)胞色素P450的活性,從而改變可作為此酶系反應(yīng)底物的藥物在體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)。柚皮素和橙皮素分別為柚皮苷和新橙皮苷的苷元,兩者也具有相似的生物活性,如抗?jié)?、抗氧化、抗腫瘤等。另外,柚皮素也是一種有效的細(xì)胞色素P450酶系抑制劑,能干擾參與辛伐他汀肝臟代謝的細(xì)胞色素P450異構(gòu)酶。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柚皮苷、新橙皮苷的生物利用度很低,只有1%～2%,柚皮苷、新橙皮苷在腸內(nèi)細(xì)菌作用下脫糖基化產(chǎn)生苷元被吸收進(jìn)入肝臟,而苷元會(huì)快速與葡萄糖醛酸結(jié)合再吸收入血。因此,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定血漿中的柚皮素與橙皮素,間接反映柚皮苷與新橙皮苷的血藥濃度,通過(guò)比較枳實(shí)總黃酮提取物、柚皮苷-新橙皮苷、柚皮苷單體、新橙皮苷單體4組中柚皮素與橙皮素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律,研究柚皮苷與新橙皮苷潛在的相互作用,為臨床合理用藥提供藥代動(dòng)力學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1藥品制品檢定所柚皮苷(純度>98%,批號(hào)20120406)、新橙皮苷(純度>98%,批號(hào)20120328)、奧蘭替胃康片(枳實(shí)總黃酮提取物,每片含枳實(shí)總黃酮以柚皮苷計(jì)為95mg)(江西青峰藥業(yè)有限公司);柚皮素(98.1%,批號(hào)22802)、橙皮素(98.22%,批號(hào)20854)(上海晶純有限公司);替米沙坦(內(nèi)標(biāo),中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)508028);β-葡萄糖醛酸苷酶G7396(型號(hào)TypeIX-A),硫酸酯酶S9626(型號(hào)TypeH-1)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。甲醇、乙腈,色譜純?cè)噭?德國(guó)Merck公司);甲酸、乙酸乙酯,色譜純?cè)噭?美國(guó)Tedia公司);水為超純水,其他試劑均為市售分析純。1.2a控制系統(tǒng)TSQQuantumAccess質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo公司);島津CBM-20A系統(tǒng)控制器;LC-20AD泵;SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器;CTO-20A柱溫箱;Milli-QGradientA10超純水器(美國(guó)Millipore公司);Eppendorfcentrifuge5430R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hamburg公司)。1.3動(dòng)物SD大鼠,體重(250±20)g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。2方法2.1柱溫、流動(dòng)相、洗脫時(shí)間。條件色譜柱:Shim-packVP-ODS柱(150mm×2.0mm,5.0μm);柱溫:35℃;流速:0.2mL/min;流動(dòng)相:乙腈-水(含0.01%甲酸)(48∶52);洗脫時(shí)間:0～6min;進(jìn)樣量:6μL。2.2輔助氣、正離子掃描離子化方式:電噴霧離子化(ESI);選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM);毛細(xì)管溫度:350℃;電離電壓:4000V;鞘氣:N2,流量:30L/min;輔助氣:N2,流量:10L/min;掃描方式:正離子掃描。選擇母離子/子離子如下:柚皮素,m/z273.00→m/z153.10(25eV);橙皮素,m/z303.00→m/z153.00(25eV);替米沙坦,m/z513.30→m/z276.09(20eV)。2.3溶液的制備2.3.1含橙皮素2.柚皮素貯備液:精密稱取柚皮素10.0mg于10mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,配制成含柚皮素1mg/mL的貯備液,于4℃冰箱內(nèi)保存。橙皮素貯備液:精密稱取橙皮素10.0mg于10mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,配制成含橙皮素1mg/mL的貯備液,于4℃冰箱內(nèi)保存。分別取儲(chǔ)備液適量并混合,臨用時(shí)用甲醇-水(50∶50)稀釋成含柚皮素與橙皮素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。2.3.2替米沙坦貯備液的配制精密稱取替米沙坦10.0mg于10mL量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,配制成含替米沙坦1mg/mL的貯備液,于4℃冰箱內(nèi)保存。取一定量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,用甲醇-水(50∶50)稀釋至1μg/mL替米沙坦內(nèi)標(biāo)溶液。2.4枳實(shí)總黃酮提取物24只SD大鼠,隨機(jī)等分為4組:枳實(shí)總黃酮提取物組(ZS),柚皮苷單體組(NA),新橙皮苷單體組(NHE),柚皮苷-新橙皮苷組(NA-NHE),實(shí)驗(yàn)前禁食12～14h,自由飲水。枳實(shí)總黃酮提取物按80mg/kg(枳實(shí)總黃酮提取物有效劑量)劑量灌胃給藥,柚皮苷及新橙皮苷分別為32mg/kg、27.2mg/kg(由枳實(shí)總黃酮提取物中兩者含量換算而來(lái),每克枳實(shí)總黃酮提取物含柚皮苷400mg,新橙皮苷340mg)劑量灌胃給藥,藥物混懸于0.5%CMC-Na。分別于給藥前及給藥后0.0833,0.25,0.5,1,2,4,6,8,10,12,14,24,30h眼眶靜脈叢取血200μL于肝素化的1.5mL離心管中,血樣于4℃下4000r/min離心10min,取上層血清,-70℃保存?zhèn)溆谩?.5酶活劑取大鼠血漿50μL,加入0.1mol/L抗壞血酸10μL,β-葡萄糖醛酸酶溶液(溶于磷酸鹽緩沖液pH=6.8,500U/mL)15μL,硫酸酯酶溶液(溶于磷酸鹽緩沖液pH=6.8,250U/mL)10μL,恒溫37℃水浴溫孵2h,后置于冰水中5min終止反應(yīng),精密加入1μg/mL內(nèi)標(biāo)替米沙坦20μL,混合均勻。用乙酸乙酯1mL萃取,渦旋3min,于4℃下4000r/min離心10min后吸取上層有機(jī)層800μL,于40℃水浴中吹干,甲醇-水(50∶50)400μL復(fù)溶,渦旋1min,復(fù)溶液18000r/min離心10min,離心兩次,取上清液6μL進(jìn)樣。2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密量取柚皮素橙皮素標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用甲醇-水(50∶50)溶液稀釋成20,50,100,500,2500,7500,15000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL于空白血漿40μL中,配制質(zhì)量濃度為4,10,20,100,500,1500,3000ng/mL系列血漿樣品。同法配制10,100,1500ng/mL的血漿樣品,作為低、中、高濃度質(zhì)控樣品。2.7藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)將血漿樣品按“2.5”項(xiàng)下方法處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖,按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血漿藥物濃度,采用軟件WinNonlin對(duì)大鼠體內(nèi)的藥時(shí)曲線進(jìn)行非房室模型擬合,算出相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),并采用SPSS11.5軟件One-wayANOVA對(duì)組之間的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。3結(jié)果3.1柚子皮素和橙皮素保留時(shí)間的測(cè)定分別取大鼠空白血漿,加入柚皮素與橙皮素及內(nèi)標(biāo)替米沙坦的加藥血漿,灌胃給藥后大鼠血漿各50μL,按“2.5”項(xiàng)下方法處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖(圖2)。由圖2可見,柚皮素和橙皮素的保留時(shí)間分別為3.64和3.93min,內(nèi)標(biāo)替米沙坦的保留時(shí)間為3.07min。血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾柚皮素、橙皮素及內(nèi)標(biāo)替米沙坦的測(cè)定。3.2生物樣品的穩(wěn)定性變柚皮素和橙皮素的線性范圍為4～3000ng/mL,最低檢測(cè)濃度為4ng/mL(RSD=10.36%),柚皮素和橙皮素低、中、高3個(gè)濃度批內(nèi)及批間變異范圍為1.96%～11.84%;兩者生物樣品在儲(chǔ)存及測(cè)定過(guò)程中穩(wěn)定性變異均在85%～115%范圍內(nèi),柚皮素在低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度下的提取回收率分別為(88.22±11.39)%,(79.90±3.82)%和(83.16±1.83)%;橙皮素在各質(zhì)量濃度下的提取回收率分別為(91.00±11.98)%,(94.66±2.93)%和(86.04±1.75)%,測(cè)定結(jié)果的RSD均符合要求。綜上,柚皮素、橙皮素含藥血漿樣品在儲(chǔ)存及測(cè)定過(guò)程中穩(wěn)定性良好,不受基質(zhì)的影響,符合生物樣本測(cè)定的要求,能夠保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.3體外藥代動(dòng)力學(xué)變化大鼠灌胃給予枳實(shí)總黃酮提取物(ZS),柚皮苷(NA),新橙皮苷(NHE)和柚皮苷-新橙皮苷(NA-NHE)后,各組的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3和4。從圖中可以看出ZS組與NA-NHE組的柚皮素、橙皮素的血藥濃度-時(shí)間曲線相似;ZS組與NA組、NHE組的柚皮素、橙皮素的血藥濃度-時(shí)間曲線有差異。采用WinNonlin軟件計(jì)算相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1和2。與柚皮苷單體組(NA)和新橙皮苷單體組(NHE)相比,枳實(shí)總黃酮提取物組(ZS)中柚皮素、橙皮素的達(dá)峰時(shí)間tmax、半衰期t1/2無(wú)顯著變化,但柚皮素、橙皮素的平均最高血藥濃度cmax分別升高了87%和84%(P<0.05),平均AUC0-t分別增加了67%和85%(P<0.05),結(jié)果表明ZS組中柚皮素、橙皮素的吸收速度及程度均顯著增加,但消除特性并未發(fā)生顯著變化,表明枳實(shí)總黃酮提取物中某些成分促進(jìn)了柚皮苷與新橙皮苷的吸收。柚皮苷-新橙皮苷(NA-NHE)組與ZS組比較發(fā)現(xiàn),兩組中的柚皮素、橙皮素的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)tmax、t1/2、cmax及AUC0-t無(wú)顯著變化,這提示柚皮素和橙皮素之間可以相互促進(jìn)吸收;NA-NHE組與NA單體組、NHE單體組比較,兩者的cmax及AUC0-t均高于單體組,在血藥濃度-時(shí)間曲線6～12h內(nèi),NA-NHE組中柚皮素、橙皮素的血藥濃度明顯高于NA單體組、NHE單體組,說(shuō)明NA-NHE組中柚皮素、橙皮素的吸收速度及程度增加,表明柚皮苷與新橙皮苷相互促進(jìn)吸收,但其增加的程度低于ZS組,這提示枳實(shí)總黃酮提取物中其他成分對(duì)柚皮苷、新橙皮苷的吸收也有一定的促進(jìn)作用。4大鼠灌胃給予柚子皮苷及其苷元糖代謝及作用在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,分別對(duì)大鼠灌胃給予80mg/kg、200mg/kg及800mg/kg不同劑量的枳實(shí)總黃酮提取物,血漿中柚皮苷、新橙皮苷兩者的最高血藥濃度均低于50ng/mL,且代謝較快,故本實(shí)驗(yàn)利用葡萄糖醛酸酶對(duì)血樣進(jìn)行預(yù)處理,測(cè)定血漿中總苷元柚皮素和橙皮素。在對(duì)健康受試者口服橙汁后血漿中柚皮苷、橙皮苷生物利用度的研究中,發(fā)現(xiàn)柚皮苷與橙皮苷的生物利用度很低,血漿中主要以苷元葡萄糖醛酸結(jié)合形式存在。Ishii等報(bào)道,健康受試者口服500mg柚皮苷后,尿液中柚皮苷的排泄量?jī)H有葡萄糖醛酸結(jié)合物排泄量的0.5%。實(shí)驗(yàn)中大鼠灌胃給藥后,柚皮素的達(dá)峰時(shí)間tmax很長(zhǎng),說(shuō)明柚皮素在體內(nèi)的吸收比較緩慢。在柚皮苷及其苷元在大鼠體內(nèi)的生物利用度研究中,柚皮苷在小腸中既不吸收也不去糖基化,但可在腸道菌群作用下生成苷元,隨后在盲腸中被吸收。大鼠灌胃給予含相同劑量枳實(shí)總黃酮提取物、柚皮苷-新橙皮苷、柚皮苷單體及新橙皮苷單體后,在血藥濃度-時(shí)間曲線中6～12h內(nèi),柚皮苷-新橙皮苷組中柚皮素、橙皮素的血藥濃度高于柚皮苷單體組、新橙皮苷單體組,兩者的cmax及AUC0-t均有所增加,說(shuō)明枳實(shí)總