腫瘤干細胞模型研究進展

腫瘤干細胞模型研究進展

現(xiàn)在，對于腫瘤的起源有兩種看法：克隆形成理論和腫瘤干燥模型。后者認為腫瘤是由一群包含各種表型和生物學特征的細胞組成,具有很強的異質(zhì)性,腫瘤形成的關(guān)鍵在于其中一小部分類似于成體干細胞的腫瘤細胞,分化程度更低,致瘤能力更強,具有自我增殖及多向分化的潛能,稱為腫瘤干細胞(Cancerstemcells,CSCs)。自1994年Lapidot等在慢性髓性白血病中首次鑒定并分離CSCs后,隨后許多研究在乳腺、結(jié)腸、前列腺、胰腺、肝臟及腦等實體腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞,這些結(jié)果提示了CSCs與腫瘤間的相關(guān)性。對此,腫瘤干細胞模型的觀點認為,CSCs是引起腫瘤發(fā)生、進展的根本原因,也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及抗藥的關(guān)鍵因素。所以,解決腫瘤干細胞的產(chǎn)生及維持對攻克腫瘤具有重要意義。CSCs的特性主要依賴于特定基因表達開放和關(guān)閉的調(diào)控,除了基本的遺傳學因素研究,進一步深入分析CSCs的分子機制是目前迫切需要解決的問題。一直以來,人們都認為腫瘤的發(fā)生與進展僅是由基因異常改變引起的,包括基因突變、易位、染色質(zhì)插入缺失等。而近年來,隨著基因組測序技術(shù)的進步,表觀遺傳學迅速發(fā)展,越來越多的研究者意識到,表觀遺傳學在腫瘤的調(diào)控中也占有一席之地。目前研究較清楚的表觀遺傳學機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及miRNA等,它們在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因表達及細胞表型。同時,腫瘤基因組測序結(jié)果也顯示,腫瘤具有特異的表觀遺傳學修飾特點,是導(dǎo)致細胞生物學特征改變、惡性轉(zhuǎn)化的重要機制。這些結(jié)果也為CSCs的調(diào)控機制提供了線索。深入解析腫瘤干細胞與表觀遺傳學的關(guān)系,不僅是理解腫瘤生理特性的突破點,更將是推進腫瘤臨床診治的關(guān)鍵。文章主要圍繞近幾年腫瘤干細胞的特性研究及表觀遺傳學線索,重點闡述表觀遺傳學對腫瘤干細胞的調(diào)控機制。1腫瘤基因的表觀遺傳組學coto1.1基因組織結(jié)構(gòu)DNA甲基化大多發(fā)生在富含CG的基因區(qū)域,由DNA轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)和DNA轉(zhuǎn)移酶3A、3B(DNMT3A、3B)催化形成,通過與甲基化結(jié)合蛋白(Methyl-bindingprotein,MBP)識別、結(jié)合,招募轉(zhuǎn)錄共抑制因子,進而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制,是表觀遺傳學調(diào)控基因表達最常見的機制之一。組蛋白修飾常發(fā)生在組蛋白的氨基端,由于暴露在染色質(zhì)外面,可接受各種化學基團的修飾,目前研究最廣的是組蛋白H3、H4上賴氨酸K的乙酰化和甲基化。當組蛋白高乙?；瘯r,基因轉(zhuǎn)錄激活;而組蛋白甲基化修飾,可根據(jù)賴氨酸的位置不同,產(chǎn)生“基因抑制或激活”的效果。其中,H3K4me3是最重要的激活性修飾,H3K27me3是最重要的抑制性修飾。染色質(zhì)重塑是另一種重要的表觀遺傳學調(diào)控機制,主要涉及4種ATP-依賴染色質(zhì)重塑因子SWI/SNF、CDH、INO80、IS10I。重塑因子間相互作用,通過形成重塑復(fù)合物,如BAF(SWI/SNF)、NURD、ISWI、CDH1及Tip60-p400等,改變?nèi)旧|(zhì)的纏繞密度,從而影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的結(jié)合,進一步調(diào)控基因表達。此外,非編碼RNA也屬于廣義的表觀遺傳學修飾范疇,尤其是微RNA(microRNA,miRNA)在基因表達調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。上述表觀遺傳學修飾類型即獨立發(fā)揮功能,又相互聯(lián)系共同作用,產(chǎn)生“協(xié)同效應(yīng)”[10~12],通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達維持機體穩(wěn)態(tài),而當其出現(xiàn)異常改變時,則會引起多種疾病,包括腫瘤。1.2其他基因組化腫瘤細胞的表觀遺傳學修飾特點包括:(1)整體的DNA低甲基化和位點特異的基因啟動子高甲基化;(2)H4K20三甲基化(H4K20me3)和H4K16乙?；?H4K16Ac)的整體下降。其中,整體的DNA低甲基化主要發(fā)生在重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子和基因內(nèi)部,造成染色質(zhì)不穩(wěn)定性以及某些基因的激活(如Ras、CyclinD2、MASPIN、MAGE、LOI);而特定基因啟動子的DNA高甲基化則主要引起抑癌基因(如CDKN2、MLH1、BRCA1、VHL)及APC、WNT通路的基因沉默。此外,腫瘤細胞還存在其他特殊的表觀修飾特點,如EZH2升高,HDAC2減少;染色質(zhì)重塑因子BAF47、BAF250A失活,Brm和Brg1雜合性缺失及miRNA水平異常。目前,雖然對腫瘤整體的表觀遺傳修飾特點比較明確,但對最關(guān)鍵的CSCs,表觀遺傳學是如何調(diào)控其表型及特性的,是目前科學研究的新熱點。2表1顯示了遺傳裝飾和csc控制的證據(jù)2.1表觀遺傳調(diào)控cscs是一個提供主要一個從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看,腫瘤干細胞具有可塑性,即CSCs的功能和表型是動態(tài)可逆的,其產(chǎn)生和維持依賴于特定基因表達的“on/off”轉(zhuǎn)換,而這一點恰好符合表觀遺傳學可逆性調(diào)節(jié)基因表達的特點,為表觀遺傳學修飾調(diào)控CSCs提供了理論上的可行性。此外,在過去幾十年的研究過程中,人們逐漸明確了表觀遺傳學在細胞發(fā)育和分化中的重要作用,在細胞發(fā)育每一個進程中都伴隨有表觀遺傳修飾的改變,靈活調(diào)控著細胞的增殖與分化,使二者處于動態(tài)平衡,指導(dǎo)細胞生長。近年來,測序技術(shù)的進步及iPS(Inducedpluripotentstemcells)細胞的出現(xiàn),對于表觀遺傳學調(diào)控發(fā)育和分化的理解有了革命性進步。最新的觀點是:表觀重編程可以極大程度上重塑細胞的多能性,是細胞分化的基礎(chǔ)。這些結(jié)果為表觀遺傳學參與正常干細胞的調(diào)控特性提供了強有力的依據(jù)。2.2cscs同源性的認識目前認為CSCs的來源主要有兩種可能:一是成體干細胞;二是具有干性特征的祖細胞。二者經(jīng)歷基因或表觀遺傳學突變,造成癌基因、抑癌基因及其他細胞關(guān)鍵基因的表達異常,打破了細胞增殖與分化間的平衡,最終產(chǎn)生永生化的致癌性CSCs。近年來,許多研究結(jié)果都證實了CSCs與正常干細胞的同源性。Schepers等通過對小腸干細胞和結(jié)腸癌進行轉(zhuǎn)錄組檢測,發(fā)現(xiàn)兩群細胞的基因表達具有一定的相似性;類似的,成體干細胞的轉(zhuǎn)錄模式在多種上皮癌中也都得到了驗證,并發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā);最重要的是,ESCs(Embryonicstemcells)的基因表達模式頻繁出現(xiàn)于分化程度低、預(yù)后差,即CSC特性顯著的腫瘤中,表現(xiàn)為Oct4、Nanog、SOX2、Klf4等干性基因高表達,且干性基因Oct4、Nanog表達上調(diào)可進一步引起CSCs比例升高,抗藥性及EMT(Epithelial-mesenchymaltransition)轉(zhuǎn)換增強。另一方面,Calvanese等通過比較人ESCs、正常組織和腫瘤細胞系中相同的806個基因的DNA甲基化水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中高甲基化的基因在ESC中大部分也是高甲基化的;結(jié)合CSCs與ESCs的同源性,作者認為,CSCs抑癌基因的DNA高甲基化很有可能是胚胎發(fā)育過程中ESCs分化時去甲基化受損導(dǎo)致的,而不是成年后額外添加的。這一觀點為CSCs的表觀遺傳學修飾來源提供了一種假說,但ESCs分化是早期事件,根據(jù)這一觀點,抑癌基因的高甲基化狀態(tài)很早就出現(xiàn),與腫瘤往往發(fā)生在個體發(fā)育后期的現(xiàn)象矛盾?？傊?這些結(jié)果都表明CSCs與正常干細胞具有同源性,而干細胞的特性在很大程度上受表觀遺傳學的調(diào)控,所以表觀遺傳學在調(diào)節(jié)CSCs的功能和表型中也具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在ESCs中規(guī)律分布的染色質(zhì)重塑因子和miRNA在腫瘤中則表達失調(diào),暗示是表觀修飾的異常改變使正常干細胞特性紊亂,變?yōu)镃SCs,從而使腫瘤發(fā)生。2.3環(huán)境與腫瘤干細胞巢腫瘤微環(huán)境與CSCs相互作用,對CSCs的調(diào)控有很重要的影響。與正常干細胞類似,腫瘤干細胞同樣依賴于周圍微環(huán)境的滋養(yǎng)與刺激,包括血管上皮細胞分泌的VEGF、淋巴細胞分泌的TNF-a、間質(zhì)細胞分泌的IL-6/IL-8/SDF-1、細胞外基質(zhì)分泌的TGF-B/ROS及其他調(diào)控因子對CSC信號通路的影響,共同構(gòu)成一個相對獨立的“生態(tài)環(huán)境”,稱為腫瘤干細胞巢(CSCniche)。腫瘤干細胞巢一方面保護CSCs免受外界刺激因素的損傷(藥物、放療等),另一方面維持CSCs自我增殖和多向分化的潛能。例如,在肝細胞癌中改變宿主的微環(huán)境(缺氧),可顯著影響腫瘤干細胞的干性基因表達及細胞表型,類似的結(jié)果在其他腫瘤中也有報道。目前研究揭示了許多對CSCs特性有顯著影響的微環(huán)境因子,如CD44BP、TLR2及CCL2等。由此可見,腫瘤微環(huán)境可以在不改變細胞遺傳物質(zhì)的情況下調(diào)控CSC的特性,而這一點與表觀遺傳學的作用方式有共通之處。研究表明,環(huán)境(包括微環(huán)境)與表觀遺傳學有非常密切的關(guān)系。Feil等指出,環(huán)境往往通過改變表觀遺產(chǎn)學修飾來改變基因表達,從而調(diào)節(jié)細胞行為,而改變微環(huán)境中巢細胞的表觀遺傳學修飾狀態(tài)可改變各種激素和刺激因子的分泌,從而影響細胞巢的狀態(tài)。所以腫瘤微環(huán)境對CSCs的調(diào)節(jié)必定也涉及到CSCs表觀遺傳學的改變。3修飾ctgf-bmp信號通路目前,越來越多的研究證實CSCs帶有異常的表觀遺傳學修飾,這些修飾通過影響Wnt/b-catenin、Hedgehog、Notch和TGF-b/BMP信號通路,調(diào)控CSC的自我更新和分化能力,表現(xiàn)為腫瘤生長、惡性程度、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及抗藥的改變。3.1dnnt1在cscs表達的調(diào)控CD133是CSCs的重要標志基因之一,由于高表達于CSCs,故可將腫瘤細胞區(qū)分為CD133+的CSCs和CD133-的non-CSCs。CD133基因在CSCs和non-CSC之間的表達差異與DNA甲基化相關(guān):在CSCs中,CD133基因啟動子區(qū)DNA低甲基化,基因表達激活,而在non-CSC中,該基因則呈現(xiàn)出DNA高甲基化,表達抑制。最有趣的是,這種由DNA甲基化引起的CD133表達量的變化是可逆的,也就是說,CD133+細胞和CD133-細胞之間可以相互轉(zhuǎn)化,而現(xiàn)有的研究也證實,腫瘤中確實存在CSCs的動態(tài)變化,這就提示我們,CSCs和non-CSC并沒有絕對的嚴格界限,二者都只是腫瘤細胞某種特定的功能狀態(tài),而表觀遺傳學是CSCs可塑性動態(tài)調(diào)控的基礎(chǔ)。目前觀點認為,特定基因的DNA甲基化在維持祖細胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用,也是CSCs表達干性的基礎(chǔ),其中,DNMT1調(diào)節(jié)DNA甲基化從頭合成的酶,對于維持CSCs的特性最為關(guān)鍵。Sen等觀察細胞分化的過程,發(fā)現(xiàn)DNMT1富集在未分化的細胞中,且去除DNMT1可導(dǎo)致細胞提前進入分化,脫離祖細胞狀態(tài),表明DNMT1能保持細胞的增殖能力,同時抑制分化;通過全基因組分析,DNMT1相關(guān)基因UHRF1及Gadd45A/B在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化中的關(guān)鍵的作用,使細胞增殖時分化基因的啟動子呈DNA高甲基化,而當細胞向分化發(fā)展時,則伴隨著分化基因的DNA去甲基化,為DNMT1維持細胞增殖、抑制細胞分化提供了強有力的依據(jù)。隨后,Trowbridge等通過條件性敲除DNMT1的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)DNMT1單倍劑量不足可阻礙淋巴瘤的進展,指出DNMT1表達缺失通過改變淋巴瘤干細胞(LSC)抑癌基因的DNA甲基化模式,并抑制相關(guān)的染色質(zhì)共同修飾,損傷LSC的增殖,致癌能力減弱,從而抑制淋巴瘤。另一方面,通過藥物抑制DNMT1的功能,對腫瘤干細胞特性也產(chǎn)生了相似的效果。Marquardt等用ZEB處理肝癌細胞后,腫瘤中CSCs比例降低,且自我增殖及致瘤能力減弱;Tsai等在淋巴瘤和乳腺癌中也得到了相同結(jié)果,當給予低劑量DNA去甲基化制劑AZA(Azacitidine)或DAC(Decitabine)后,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路的基因甲基化狀態(tài)改變,CSCs數(shù)量降低,小鼠存活時間延長,從反面證明DNMT1的存在是維持CSCs所必須的。關(guān)于DNMT1維持CSCs干性的機制,目前研究認為,DNMT1在CSCs中作用的靶點主要包括抑癌基因、分化相關(guān)基因、干性相關(guān)通路基因。其中,BMP通路是促進干細胞分化、調(diào)控細胞干性的關(guān)鍵通路之一,膠質(zhì)母細胞瘤CSCs中,BMP受體BMP1B由于基因啟動子區(qū)高甲基化而表達沉默,抑制BMP通路,從而維持CSCs低分化、惡性高、預(yù)后差的特性,且BMP1B同時受EZH2介導(dǎo)的抑制性組蛋白修飾,協(xié)同抑制CSCs的分化通路。此外,WNT通路可體現(xiàn)CSCs的功能狀態(tài),deSousaEMeloF等發(fā)現(xiàn),WNT通路靶基因啟動子的高甲基化常導(dǎo)致結(jié)腸癌的復(fù)發(fā),“干性”增強,暗示W(wǎng)NT通路參與DNMT對CSCs的調(diào)控。3.2cscs的激活PcGs(Polycombgroupproteins)是催化組蛋白抑制性修飾的重要蛋白,主要由PRC1和PRC2復(fù)合物組成,PRC2的活性亞基EZH2催化組蛋白形成H3K9me和H3K27me,而PRC1的活性亞基BMI1催化組蛋白形成H2AUbiq(泛素化),二者同時發(fā)揮沉默基因的作用。研究表明,PcG復(fù)合物在維持CSCs的干性表型中發(fā)揮廣泛而重要的作用。在EZH2基因敲入小鼠模型中,通過誘導(dǎo)造血干細胞的EZH2表達,促進骨髓增生異常綜合征,體現(xiàn)了EZH2對干細胞增殖能力的影響;在T細胞淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中,上調(diào)EZH2的表達水平,可直接檢測到CSCs數(shù)量的增多[40~44],而藥物阻斷或下調(diào)EZH2,則會導(dǎo)致CSCs自我增殖能力減弱,表面標記減少,致瘤能力受到抑制。類似的,PcG的另一個亞基BMI1,其表達水平與CSCs的干性也呈正相關(guān)。惡性程度高的腫瘤常伴隨高水平的BMI1,可促進CSCs的自我增值能力,而人為敲除BMI1基因使其表達下調(diào),則阻礙了CSC的克隆形成能力,使腫瘤的形成受到抑制。此外,組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1在CSCs中的表達量也遠高于non-CSC,且當下調(diào)MLL1時會抑制HIF2a及其他相關(guān)基因表達,使CSCs的自我增殖和致瘤能力減弱。這些結(jié)果指出,抑制性組蛋白修飾與維持CSCs干性表型的具有一致性。另一方面,調(diào)控激活性組蛋白修飾H3K4me3也可影響CSCs的干性表型。LSD1/KDM1是組蛋白去甲基化酶,可消除組蛋白的H3K4me3修飾,使原來活化的基因表達沉默。通過給予LSD1抑制劑,使H3K4me3修飾水平升高,活化基因,可抑制多能腫瘤細胞的增殖,表現(xiàn)為CSCs干性減弱,這一結(jié)果在畸胎瘤、胚胎癌及精原細胞瘤中都得到了驗證。組蛋白修飾主要通過調(diào)控細胞分化增殖中的重要信號通路,影響CSCs的特性。哺乳動物腫瘤的全基因組測序結(jié)果顯示,WNT基因上的EZH2和H3K27me3修飾水平升高,而EZH2過表達可使WNT拮抗劑DACT3的基因轉(zhuǎn)錄抑制,激活腫瘤細胞的WNT/b-catenin通路,造成管內(nèi)上皮增生,維持CSCs的自我更新能力;相反,使用小分子抑制劑阻斷EZH2時,則可顯著抑制腫瘤增殖。此外,神經(jīng)母細胞瘤中EZH2通過誘導(dǎo)BMP受體BMPR1B表達沉默,下調(diào)BMP通路,抑制BMP2/4介導(dǎo)的細胞分化,從而使CSCs維持在低分化水平。3.3mir在cscs治療的作用染色質(zhì)重塑蛋白SNF5可通過與靶基因啟動子區(qū)相互作用,改變DNA構(gòu)象,從而影響Hh通路功能蛋白與啟動子的相互作用,當SNF5高表達時,Gli與啟動子接近受阻,抑制Hh通路調(diào)控干細胞和祖細胞增殖的功能;人惡性rhabdiod腫瘤中,SNF5失活,表達減少,Gli與靶基因相互作用增強,從而促進CSCs的增殖。此外,miRNA也是調(diào)控CSCs特性的重要表觀遺傳學機制。CSCs中表達減少的miRNA稱為抑癌性miRNA,可負性調(diào)節(jié)CSCs的自我增殖和致瘤能力,抑制干性。例如,研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤中低水平的Let-7常與腫瘤的惡性進展相關(guān)。前列腺CSCs的let-7水平顯著低于non-CSC,當人為上調(diào)let-7表達時,發(fā)現(xiàn)細胞分化程度增加,CSCs的自我增殖及致癌能力減弱;更有趣的是,發(fā)現(xiàn)let-7的下降與EZH2高表達協(xié)同出現(xiàn),而上調(diào)let-7的表達則會引起EZH2表達減少,同時出現(xiàn)CSCs自我增殖能力被抑制,表明let-7的下調(diào)和EZH2的上調(diào)共同維持CSCs的干性。此外,miR-200b和miR-200c也可負性調(diào)節(jié)CSCs的特性,乳腺癌中miR-200b和miR-200c的升高會導(dǎo)致CSCs增殖和致瘤能力的減弱,而下調(diào)miR-200b和miR-200c,則可引起B(yǎng)MI1、Suz12及H3K27me的上調(diào),促進CSC的干性功能,再次證實了miR與組蛋白修飾間的協(xié)同效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)了另一個抑癌性miRNA—miR-34a,在前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌等惡性腫瘤的CSCs中,miR-34a都呈現(xiàn)為低表達水平,且胰腺癌中低表達的miR-3