次聲作用后大鼠下丘腦室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化

次聲作用后大鼠下丘腦室旁核小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化

第二次聲采集是由物體（材料）的機(jī)械振動(dòng)引起的，頻率為0.0001.20hz。次聲廣泛存在于我們的環(huán)境中,這些低頻噪聲除污染環(huán)境并危害著人們的健康。次聲噪音和次聲武器作用于人體后可產(chǎn)生多種危害,可以引起機(jī)體行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、蛋白、分子等多方面的改變。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MI)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐的免疫細(xì)胞,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷、卒中、炎性以及神經(jīng)變性性疾病的發(fā)病過(guò)程。因此,研究次聲作用后MI的變化對(duì)了解次聲性腦損害機(jī)制和腦保護(hù)的研究具有十分重要的理論和實(shí)用價(jià)值。本文對(duì)大鼠下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PA)進(jìn)行OX42和抗GFAP免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)記染色。對(duì)次聲作用后不同時(shí)間點(diǎn)MI變化情況及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行了觀察。材料和方法一、大鼠次聲作用成年雄性SD大鼠20只,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重250～300g。隨機(jī)分為次聲作用1d組,7d組,14d組和對(duì)照組,每組5只大鼠。小鼠抗OX42單克隆體(1:800,Chemicon公司),兔抗GFAP單克隆抗體(1:1500,Chemicon公司)。二、方法1.電激勵(lì)式次聲壓力顱內(nèi)壓力次聲作用次聲作用組大鼠每天置于本校研制的電激勵(lì)式次聲壓力艙內(nèi)給予16Hz130dB次聲每天2h,對(duì)照組動(dòng)物每天放入次聲艙內(nèi)無(wú)次聲作用。2.動(dòng)物分組、大鼠蔗糖沉底將大鼠暴露于次聲環(huán)境后,麻醉大鼠(戊巴比妥鈉40mg/kg,腹腔注射),用過(guò)碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛液(periodate-lysine-paraform-alde-hydefixative,PLP)固定液灌注固定大鼠,30%蔗糖沉底。取前腦,恒冷切片機(jī)冠狀切片,片厚30μm,切片分套,置于60%甘油中-20℃存放。3.小鼠血清學(xué)檢測(cè)取一套切片在0.01mol/L磷酸鉀鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline,PBS)中漂洗3次,每次10min。然后入含有OX-42(1:800,Chemicon公司)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillarylacidicprotein,GFAP)(1:1500,Chemicon公司)兩種抗體的稀釋液,孵育48h(4℃);再經(jīng)德克薩斯紅(Texasred)標(biāo)記的羊抗兔(1:500,Sigma)和異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1:500,Sigma)抗血清室溫孵育2h(避光),甘油PBS封片,顯微鏡下觀察。每步驟后均用0.01mol/LPBS充分洗滌(漂洗3次,每次10min)。陰性對(duì)照以0.01mol/LPBS代替抗相應(yīng)抗體液。4.圖像分析方法光鏡下(Bx-51,Olympus,Japan)觀察下丘腦切片并應(yīng)用軟件(LeicaQ570c圖像分析系統(tǒng),Germany)采集圖像;應(yīng)用Image-ProPlus軟件分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù):在相同電壓下測(cè)量大鼠下丘腦一個(gè)視野一定區(qū)域內(nèi)OX42、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(×200);實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應(yīng)用GraphPadPrism軟件,用單因素方差分析法(One-wayANOVA)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果一、mi被激活的原因由圖1A2-D2可見對(duì)照組大鼠PA區(qū)的0X42陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少(光密度值為64.54±14.03),為靜息狀態(tài),表現(xiàn)為胞體小、核呈現(xiàn)扁長(zhǎng)或多角形,突起長(zhǎng);次聲作用后1dMI被激活:表現(xiàn)為MI數(shù)量顯著增多(光密度值為97.24±10.03,P<0.01);0X42陽(yáng)性細(xì)胞深染,胞體變大變圓,突起變短、變粗長(zhǎng)。次聲連續(xù)作用7d后,大多數(shù)0X42陽(yáng)性的MI還是表現(xiàn)為活化狀態(tài),但細(xì)胞數(shù)量與1d組相比明顯降低(光密度值為82.43±8.87,P<0.05),但此數(shù)值仍高于對(duì)照組。而次聲連續(xù)作用14d后,0X42陽(yáng)性的活化MI數(shù)量恢復(fù)到正常水平(光密度值為69.81±11.49),但活化的MI的比例仍占多數(shù)。二、gfap光密度值的測(cè)定由圖1A1-D1可見隨著次聲作用天數(shù)的增加大鼠下丘腦室旁核GFAP陽(yáng)性細(xì)胞開始逐漸增多、密集且胞體變大,突起變短、增多、變粗變長(zhǎng),呈活化狀態(tài)(對(duì)照組GFAP光密度值為40.19±1.85,次聲作用后1d,7d,41d的光密度值分別為42.99±3.10,56.90±2.64,69.72±3.86,P<0.01)。GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在第7d時(shí)數(shù)量開始增加,并且14d組最為密集,活化最明顯。三、mi與星形膠質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)系多表現(xiàn)為第一由圖1A3-D3可見正常大鼠MI分布與星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)特殊關(guān)系,而隨著次聲作用時(shí)間的延長(zhǎng),MI與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系逐漸密切,大多成對(duì)出現(xiàn),此外還可發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞間出現(xiàn)橙黃色的雙標(biāo)記突起,且有這種聯(lián)系的突起數(shù),隨著次聲作用天數(shù)的增加逐漸增多。mi通過(guò)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)誘導(dǎo)mi作次聲被公認(rèn)為體外環(huán)境應(yīng)激源之一,機(jī)體的生理—心理反應(yīng)即應(yīng)激是機(jī)體對(duì)次聲產(chǎn)生反應(yīng)的重要方面。強(qiáng)度次聲作用后可破壞人的適應(yīng)能力,出現(xiàn)頭痛、惡心、疲倦、注意力不能集中等癥狀。失控的活化MI可能通過(guò)釋放許多不同的物質(zhì)比如炎性細(xì)胞因子,谷氨酸及超氧化物等直接對(duì)中樞神經(jīng)造成損傷。基與此,近年來(lái)MI在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來(lái)越受到重視。目前有關(guān)次聲的研究主要集中在氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、過(guò)氧化反應(yīng)等方面,而有關(guān)MI與次聲的關(guān)系方面還沒(méi)有人報(bào)道。次聲可損害腦的邊緣葉、下丘腦等皮層下結(jié)構(gòu),可以引起機(jī)體行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、蛋白、分子等多方面的改變,出現(xiàn)間腦-下丘腦綜合征。下丘腦是植物神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)調(diào)控機(jī)關(guān),可通過(guò)垂體調(diào)節(jié)重要的激素系統(tǒng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌器官與植物神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用。既往的研究指出次聲作用后下丘腦室旁核CRH表達(dá)有明顯的增加;下丘腦室旁核小細(xì)胞部細(xì)胞分泌的促腎上腺素釋放激素(corticotrophin-regulatingfactor,CRF)是下丘腦-垂體-腎上腺軸的重要因子。皮質(zhì)類固醇受體不僅僅表達(dá)與神經(jīng)元還表達(dá)在MI上,外源性CRH可使MI活化,并增加其炎性細(xì)胞因子的釋放。應(yīng)激反應(yīng)所造成的外周免疫反應(yīng)可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前炎性免疫應(yīng)答。MI可以經(jīng)突觸活化,這意味著它可能是應(yīng)激的應(yīng)答者。Nair和Bonneau最近報(bào)道慢性應(yīng)激可以誘導(dǎo)MI活化和增殖,這一效應(yīng)被糖皮質(zhì)激素和N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體介導(dǎo)。Frank等報(bào)道電刺激24h后可以使MI活化的表面標(biāo)志物主要組織相容性(抗原)復(fù)合物II(majorhistocompabilitycomplexII,MHCII)表達(dá)上調(diào),而星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP沒(méi)有變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣提示MI的變化早于星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化。以往的研究表明次聲作用后對(duì)下丘腦產(chǎn)生的其他影響如:細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等也是在第7d時(shí)才開始改變,在次聲作用28d后中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)次聲損傷開始適應(yīng),大多數(shù)損傷指標(biāo)恢復(fù)正常。MI激活后可以分泌許多細(xì)胞因子,誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖,少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化以及血管發(fā)生等。由此可以看出次聲作用可以引起MI的變化,并且這種變化早于腦中其他細(xì)胞、分子的變化,這些細(xì)胞、分子的后反應(yīng)可能部分是由于MI活化而釋放的一系列物質(zhì)的結(jié)果。眾所周知縫隙連接可以存在與相同類型細(xì)胞間比如:神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞;它們也可能存在與不同細(xì)胞類型間比如:神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞,神經(jīng)元與MI,MI與星形膠質(zhì)細(xì)胞間;有報(bào)道指出在小鼠大腦皮層內(nèi)MI的突觸與星形膠質(zhì)細(xì)胞的突觸、神經(jīng)元胞體、血管直接接觸。我們的研究發(fā)現(xiàn)次聲作用后大鼠下丘腦室旁核MI早期就開始活化,活化的MI主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍,且隨次聲作用時(shí)間的增加兩者間關(guān)系越來(lái)越密切,可以看出兩者間的雙標(biāo)記突起越來(lái)越多,這種雙標(biāo)記突起可能為兩者間形成縫隙連接。由此可以看出一定強(qiáng)度的次聲作用于人體后,可以對(duì)下丘腦室旁核造成