穹窿切口對大鼠下丘腦crh表達的影響

穹窿切口對大鼠下丘腦crh表達的影響

應激反應的主要特征是以下肢-腎上腺-戈爾巴斯（hy皮亞-戈爾巴斯，hpa軸）激活為核心的生理和心理反應。應激后促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin-releasinghormone,CRH)在HPA軸中發(fā)揮重要作用,控制著HPA軸的興奮水平。海馬不僅是應激損傷的敏感區(qū),而且還是HPA軸應激反應的高位反饋調節(jié)中樞。大量研究證明,海馬在抑制HPA軸的應激反應中起著非常重要的作用,刺激海馬可抑制應激誘導的皮質酮的分泌;相反,損傷整個海馬或海馬背側,血漿糖皮質激素異常升高。但是對于海馬如何調節(jié)下丘腦的機制還不十分清楚,本研究通過大鼠穹窿切斷模型,用免疫組織化學、Westernblot方法對大鼠下丘腦室旁核(PVN)神經元CRH表達變化和分布規(guī)律進行檢測,旨在為研究海馬調節(jié)下丘腦的機制提供豐富的理論和形態(tài)學證據。材料和方法1.實驗1成年雄性Wistar大鼠80只(由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供),體重180-200g,常規(guī)飼養(yǎng)于環(huán)境溫度22℃和8:00~20:00定時光照的房間,食物和水可自由攝取。隨機分為穹窿切斷0d、4d、7d、10d組及相應的假手術組,每組10只。2.腦電wat大鼠經2%戊巴比妥鈉(35-40mg/kg)麻醉后,固定于腦立體定位儀(江灣IC型),常規(guī)消毒、剪毛、正中切開皮膚,暴露出顱骨,參照Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜,于前囟后1.5mm,中線外左右各1.0mm處,用電動開顱器鉆開顱骨,切開硬腦膜,用自制雙刃刀先置于上述部位的腦表面,接著降刀6mm,持續(xù)1min,然后刀在腦中停留5min,以保證切斷穹窿。假手術組降刀2mm,其余處理同上。清潔顱骨,縫合頭皮,手術實施后在安靜條件下常規(guī)飼養(yǎng),抗生素抗感染。3.化療后人腦林的處理分別于術后0d、4d、7d、10d對穹窿切斷組及假手術組大鼠進行灌流固定。大鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,暴露心臟,左心室插管,剪開右心耳,先以生理鹽水300ml灌沖,再灌注4%多聚甲醛進行固定,取出腦組織,分離出下丘腦并浸入同種固定液中續(xù)固定3h,然后浸于Holt′s液中至沉瓶底。于恒冷冰凍切片機中冠狀切片,片厚14μm,用于免疫組織化學染色。4.sreh-1x-100和bsa的測定采用常規(guī)SABC法,各步驟間用PBS洗3次,主要步驟為:①3%H2O2室溫孵育10min;②0.3%TritonX-100室溫10min;③5%BSA室溫20min;④一抗CRH抗體(1:500,博士德公司)4℃過夜;⑤二抗及SABC(SABC試劑盒,博士德公司)均為37℃、20min;⑥DAB顯色,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察,攝片。免疫反應對照用PBS代替一抗,結果為陰性。5.蛋白濃度測定提取大鼠下丘腦組織蛋白,并定量。以12000r/min,4℃離心30min,上清液移至另一EP管(100μl/管)中,于試管中加考馬斯亮藍染液3ml和蛋白上清液5μl,混勻后測定蛋白濃度。每EP管加等量加樣緩沖液(100μl),根據蛋白濃度計算所需上樣量(注:以上操作均在冰板上進行)。聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為40μg總蛋白),電泳結束后轉印到硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉60min、加一抗(1:1000,博士德公司)4℃過夜,HRP標記IgG(1∶1500,博士德公司)2h,DAB法顯色10min,dH2O漂洗,PVDF膜常溫晾干后進行定量檢測。6.平均光密度計算采用MoticImagesAdvanced3.2圖像分析系統(tǒng),檢測下丘腦PVN內每高倍鏡(10×40倍)視野內CRH的光密度值,每張切片選2個視野,計算各組平均光密度(OD)值。Westernblot結果圖像掃描后分析各條帶的平均光密度(OD)值。結果用xˉ±sxˉ±s表示,SPSS11.0軟件進行方差分析。結果1.生長和crh表達CRH免疫反應陽性產物呈棕黃色斑塊狀,主要分布于PVN的內側亞核和后部亞核的小細胞核周部細胞質內(圖1),亦見延伸至突起中,但軸突甚少(圖2,3)。穹窿切斷后4d未見CRH表達變化(圖4);7d開始CRH表達增強(圖5,表1);10d表達尤著,細胞數目亦見增多,胞體漸大,胞質CRH表達明顯增強(圖6,表1)。假手術組各組中僅有少量的CRH分布于PVN神經元的胞漿,免疫反應產物較淡,分布均勻,無變化。2.dcrh含量比較Westernblot結果顯示,穹窿切斷后7d下丘腦CRH蛋白含量明顯增加,呈逐漸增加趨勢,10dCRH含量表達更高,與7d比較,有顯著差異(P<0.05)。下丘腦CRH蛋白含量在假手術組中有一定表達,但含量較低,且0d、4d、7d、10d變化不明顯。應激作用的抑制性調節(jié)CRH是一種含41個氨基酸的肽,與機體的內分泌、生理和行為反應密切相關。CRH廣泛表達于中樞神經系統(tǒng)(CNS),但在應激后僅在下丘腦表達增加。下丘腦室旁核(PVN)是HPA軸活動的直接控制部位。應激狀態(tài)下,PVN分泌CRH經正中隆起、垂體門脈系統(tǒng)作用于垂體前葉細胞上高度表達的CRHR1(CRH的I型受體),刺激垂體前葉合成、分泌ACTH,促進腎上腺皮質分泌糖皮質激素(GC),發(fā)揮神經內分泌功能,促使機體各組織發(fā)生應激防御反應來保持內環(huán)境的穩(wěn)定。大量研究表明,海馬可抑制HPA軸的活性。電刺激海馬可抑制應激誘導的皮質類固酮的分泌;相反,損傷整個海馬或海馬背側,則下丘腦PVN的CRHmRNA和AVPmRNA增加,HPA軸對多種應激原的敏感性增強,血漿糖皮質激素異常升高?？梢?海馬參與了HPA軸應激反應的抑制性調節(jié)。有研究表明,切除海馬可出現HPA軸晝夜節(jié)律的改變或消失,表現為多種動物血漿皮質類固醇低谷值和峰值差距縮小,即血漿皮質類固醇的低谷值升高,峰值基本不變。從海馬到室旁核沒有直接的神經投射,一個間接路徑就是中隔核和基底核獲得來自海馬的傳入信息,通過穹窿投射到PVN或者PVN附近的區(qū)域;另一個間接路徑就是海馬的傳入信息通過內側皮質下丘腦束直接投射到內側小細胞性PVN,而且皮質下丘腦束的神經纖維是進入到穹窿中的。這些研究提示穹窿是海馬和室旁核之間聯(lián)系的橋梁。所以,從海馬投射到室旁核的神經纖維無論經過何種路徑都要匯聚到穹窿,由此可以推斷海馬對室旁核的抑制作用可能由穹窿纖維介導。在本實驗中切斷穹窿觀察CRH