【生物】微生物的培養(yǎng)技術及應用（第二課時） 高二生物同步備課系列（人教版2019選擇性必修3）

發(fā)酵工程是指利用微生物的特定功能，通過現(xiàn)代工程技術，規(guī)?；a(chǎn)對人類有用的產(chǎn)品。它涉及菌種的選育和培養(yǎng)、產(chǎn)物的分離和提純等方面。第1章發(fā)酵工程選擇性必修三生物技術與工程目錄CONTENT01新課導入02任務探究03課堂練習課堂小結(jié)04第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術及應用第二課時

微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)問題思考自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合的菌群中不是優(yōu)勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現(xiàn)。該怎么辦呢?新課導入一、選擇培養(yǎng)基【任務一】1.閱讀課本16頁第2段，通過尋找耐高溫的DNA聚合酶，明確可以篩選出來的原因，這為實驗室篩選微生物提供什么提示？說出選擇培養(yǎng)基的定義。任務探究1.科學實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的Taq細菌保留下來。PCR是一種在體外DNA復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找那么，如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？一、選擇培養(yǎng)基1966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的Taq細菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）?！救蝿找弧?.閱讀課本16頁第2段，通過尋找耐高溫的DNA聚合酶，明確可以篩選出來的原因，這為實驗室篩選微生物提供什么提示？說出選擇培養(yǎng)基的定義。人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。耐寒微生物耐熱微生物石油分解菌2.實驗室中微生物的篩選原理：一、選擇培養(yǎng)基【任務一】1.閱讀課本16頁第2段，通過尋找耐高溫的DNA聚合酶，明確可以篩選出來的原因，這為實驗室篩選微生物提供什么提示？說出選擇培養(yǎng)基的定義。允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。3.選擇培養(yǎng)基：不加氮源自養(yǎng)微生物酵母菌和霉菌(青霉素能殺死細菌、放線菌)固氮微生物加入青霉素加高濃度食鹽金黃色葡萄球菌石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物不加碳源一、選擇培養(yǎng)基【任務一】1.閱讀課本16頁第2段，通過尋找耐高溫的DNA聚合酶，明確可以篩選出來的原因，這為實驗室篩選微生物提供什么提示？說出選擇培養(yǎng)基的定義。一、選擇培養(yǎng)基【任務一】2.閱讀16頁思考討論“選擇培養(yǎng)基配方的設計”，完成討論題。

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細菌分解成NH3,再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。討論：1.你如何設計培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來？2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖?！救蝿找弧?.閱讀16頁思考討論“選擇培養(yǎng)基配方的設計”，完成討論題。一、選擇培養(yǎng)基這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分基本相同。二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml①原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。②配方：制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對照作用思考1：為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？①提供無機鹽；②調(diào)節(jié)pH。1.選擇培養(yǎng)基的制備二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。2.稀釋土壤樣品（1）土壤取樣二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。2.稀釋土壤樣品（2）樣品的稀釋測細菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。測放線菌：一般用103、104、105稀釋液。測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液。不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板。BAC思考2：在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)？選用稀釋范圍更大的稀釋液進行平板培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml107稀釋10倍菌液101①在火焰旁稱取土壤10g，加入90ml無菌水中，搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液。③分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，制成不同稀釋倍數(shù)的菌液。②取6支試管，分別加入9ml無菌水。（2）樣品的稀釋3.取樣涂布平板：滴①取0.1ml菌液（不超過），滴加到培養(yǎng)基表面。②將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中（盡量滴盡酒精后灼燒）。

浸二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。灼③將涂布器在火焰上灼燒，待酒精燃盡后，涂布器冷卻后，再進行涂布。涂④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)。3.取樣涂布平板：各梯度分別涂布至少3個平板2個不涂布作空白對照二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。選擇培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用？一浸、二滴、三燒、四涂設置兩個空白對照：不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。以驗證培養(yǎng)基中是否含有雜菌原則：確保菌落數(shù)在30—300之間接種：用稀釋液涂布平板。3.取樣涂布平板：二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。①不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。②每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。③一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。注意：設置對照組一同培養(yǎng)對照組：驗證是否有雜菌：未接種的選擇培養(yǎng)基、未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

驗證是否具有篩選作用：接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基4.微生物的培養(yǎng)與觀察二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】1.閱讀課本17頁和18、19頁的探究實踐“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)，明確實驗各步驟的具體操作，嘗試計算單位土壤中的細菌數(shù)量。平板劃線法稀釋涂布平板法關鍵操作注意事項菌體獲取優(yōu)點缺點二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】2.根據(jù)課本和所學知識，對比平板畫線法和稀釋涂布平板法，完成下表。平板劃線法稀釋涂布平板法關鍵操作接種環(huán)在固體平板培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線①一系列的梯度稀釋②涂布平板法操作注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環(huán)稀釋度要足夠高，為確保試驗成功可以增加稀釋度的范圍菌體獲取在具有顯著的菌落特征的區(qū)域菌落中挑取菌體從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體優(yōu)點可以根據(jù)菌落的特點獲得某種微生物的單細胞菌落既可以獲得單細胞菌落，又能對微生物計數(shù)缺點不能對微生物計數(shù)操作復雜，需要涂布多個平板二、微生物的選擇培養(yǎng)【任務二】2.根據(jù)課本和所學知識，對比平板畫線法和稀釋涂布平板法，完成下表。三、微生物的數(shù)量測定【任務三】閱讀課本18頁第2-4段，明確微生物的數(shù)量測定中的方法，并對每種方法進行分析。①原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計數(shù)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。選擇30-300個菌落的平板進行計數(shù)；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；統(tǒng)計的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)；統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低；恰當?shù)南♂尪?、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵。②計數(shù)原則缺點：因為當兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成的還是一個菌落。1.間接計數(shù)法—稀釋涂布平板法三、微生物的數(shù)量測定【任務三】閱讀課本18頁第2-4段，明確微生物的數(shù)量測定中的方法，并對每種方法進行分析。不能區(qū)分死菌與活菌；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；2.直接計數(shù)—計數(shù)板計數(shù)法①原理：利用細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。②缺點：（“染色排除法”）三、微生物的數(shù)量測定【任務三】閱讀課本18頁第2-4段，明確微生物的數(shù)量測定中的方法，并對每種方法進行分析。實例分析1：甲同學做此實驗在稀釋倍數(shù)105獲得3個平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數(shù)目？3.計算：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。（80+90+100）/30.1×105=9×107個三、微生物的數(shù)量測定【任務三】閱讀課本18頁第2-4段，明確微生物的數(shù)量測定中的方法，并對每種方法進行分析。課堂小結(jié)微生物的數(shù)量測定選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋涂布平板法微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)科學實例篩選原則選擇培養(yǎng)基的概念及舉例稀釋涂布平板法的操作過程間接計數(shù)法—稀釋涂布平板法直接計數(shù)—計數(shù)板計數(shù)法土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)培養(yǎng)基的制備（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養(yǎng)與觀察實驗設計課堂練習1.(2023·山東卷)金黃色葡萄球菌是一種病原菌，它可耐受質(zhì)量分數(shù)為7.5%的NaCl溶液。金黃色葡萄球菌在添加適量血液的血平板上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。為檢測鮮牛奶中是否存在金黃色葡萄球菌，科研人員設計了如圖所示的流程。下列說法錯誤的是（）A.振蕩培養(yǎng)時應選用含質(zhì)量分數(shù)為7.5%NaCl溶液的鑒別培養(yǎng)基B