檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷(五篇)

第頁(yè)共頁(yè)檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷(五篇)檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷篇一班》心得本人于2024年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班。通過(guò)學(xué)習(xí)，除了獲得廣東省臨檢中心頒發(fā)的培訓(xùn)證書(shū)外，還極大的進(jìn)步了理論和實(shí)驗(yàn)操作程度，現(xiàn)總結(jié)如下。此次培訓(xùn)包括理論培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)操作。在理論培訓(xùn)課程當(dāng)中，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的李金明教授為我們?cè)敿?xì)講解了《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及質(zhì)量管理體系的建立》、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證》等內(nèi)容。通過(guò)學(xué)習(xí)，理解到臨床pcr實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)必須遵循各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜，方便工作的原那么。質(zhì)量管理的內(nèi)涵：寫(xiě)你所做的，做你所寫(xiě)的，記錄你已做的，分析^p你已做的。認(rèn)識(shí)到臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存的重要性，是臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一。同時(shí)通過(guò)病例分析^p，對(duì)于臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的檢驗(yàn)前，檢驗(yàn)中，檢驗(yàn)后的質(zhì)量控制，還有實(shí)驗(yàn)的結(jié)果處理和分析^p有了重新認(rèn)識(shí)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室是否出現(xiàn)污染的鑒別，以及出現(xiàn)污染的處理措施有了深入理解。臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的開(kāi)展如今經(jīng)歷了三個(gè)時(shí)代，分別是生化診斷時(shí)代，免疫診斷時(shí)代，和和如今的分子〔基因〕診斷時(shí)代，而現(xiàn)今時(shí)代的標(biāo)志性技術(shù)正是pcr技術(shù)，是反映疾病本質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。正是有臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應(yīng)用，通過(guò)驅(qū)動(dòng)基因的選擇，為靶向治療患者延長(zhǎng)了生存期。為個(gè)體化診療中對(duì)疾病的鑒別診斷，診治方案的設(shè)定提供重要的參考根據(jù)，同時(shí)也為治療過(guò)程中臨床對(duì)于治療方案的調(diào)整提供根據(jù)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)在個(gè)體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強(qiáng)大的開(kāi)展?jié)摿颓熬?。?shí)驗(yàn)操作內(nèi)容為egfr突變基因檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，通過(guò)認(rèn)真學(xué)習(xí)和細(xì)致聽(tīng)講帶教教師的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作，理解到了實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作，糾正了平常在臨床實(shí)際工作操作上的一些不良習(xí)慣，為日后標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作提供了根底。通過(guò)分組親自操做實(shí)驗(yàn)，分析^p和判斷自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，做實(shí)驗(yàn)記錄筆記，根本掌握egfr突變基因檢測(cè)。通過(guò)為期六天的理論和實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)，從中學(xué)習(xí)到了很多知識(shí)，掌握了嚴(yán)格的防污染以及污染的處理措施，理解到實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的人流、物流、氣流的走向設(shè)計(jì)原那么，解決了日常工作中的實(shí)際問(wèn)題，為日后臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作的開(kāi)展打下了堅(jiān)實(shí)的根底。理解到臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)的開(kāi)展方向，受益匪淺。檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷篇二pcr經(jīng)歷總結(jié)sdesign這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量。b____%40%-60%c5'端和中間序列要多____,以增加穩(wěn)定性d防止3'端____rich,最后3個(gè)base不要有____,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是____e.防止3'端的互補(bǔ),否那么容易造成dimerf.防止3'端的錯(cuò)配g.防止內(nèi)部形成二級(jí)構(gòu)造h.附加序列(rtsite,promotersequence)加到5'端,在算tm值時(shí)不需要加上這些序列,但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)構(gòu)造是要加上它們i.需要使用兼并引物時(shí),要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1um-3um)j.最好學(xué)會(huì)使用一種design5,oligo6,dnastar,vectornti,onlinedesginetal.*引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度〔tm〕。這是當(dāng)50％對(duì)于設(shè)定pcr退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的tm低5℃。設(shè)定tm有幾種公式。有的是來(lái)于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)____含量估算tm。確定引物tm最可信的方法是近鄰分析^p法。這種方法從序列一級(jí)構(gòu)造和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析^p法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析^p幾個(gè)逐步進(jìn)步退火溫度的反響以進(jìn)步特異性。開(kāi)場(chǎng)低于估算的tm5℃，以2℃為增量，逐步進(jìn)步退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最正確結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的tm值。引物對(duì)的tm差異假如超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。假如兩個(gè)引物tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的tm低5℃或者為了進(jìn)步特異性，可以在根據(jù)較高tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)展5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)展剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。ityofprimers定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)pcr應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在te重溶引物，使其最終濃度為100μm。te比去離子水好，因?yàn)樗膒h經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴(lài)于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μm濃度溶于te的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫〔15℃到30℃〕僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫〔15℃到30℃〕最多可以保存2個(gè)月。zereactantsconcentrationiomionsmg離子的作用主要是dntp-mg與核酸骨架互相作用，并能影響polymerase的活性。一般的情況下mg的濃度在0.5-5mm之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dntps的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整mg離子的濃度。對(duì)實(shí)時(shí)定量pcr，使用3-5mm帶有熒光探針的鎂離子溶液。b.其他的離子nh4+k+都會(huì)影響pcr。增加k+的濃度后,會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了pcr的嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).nh4+公司的taq酶就提供了兩種buffer,一種是加mg的一種是已經(jīng)混合了(nh4)2so4的.當(dāng)然,過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(kcl》0.2m)時(shí),dna在94度根本不會(huì)發(fā)生變性,rase不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握合適的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情況下,變性的溫度可以使用90~92度,變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性te50ulpcrsystemhumangdna0.1ug-1ug10ng-100nglamadadna0.5ng-5ngplasmiddna0.1ng-10ngatureration常規(guī)是94度5分鐘,____rich的摸板是95度5分鐘，除了____rich外,常規(guī)的applications可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘,或者在cycle1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開(kāi)場(chǎng)的denaturationing重點(diǎn)到了。一般情況下,是從55度開(kāi)場(chǎng).根據(jù)情況配合以mg離子濃度進(jìn)展調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時(shí)間在30-60s,時(shí)間短一些可以得到更好的效果.因?yàn)?polymerase在annealingtemp.時(shí)也會(huì)有一些活性.所以在a.t.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn).另外,在對(duì)于一些困難戶(hù),比方從gdna里擴(kuò)增大片段,還可使用twostepownpcr原理很簡(jiǎn)單,但確實(shí)是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子就ok,annealingtemp.55度945min—〔9430s—6030s—721min〕×2—〔9430s—5930s—721min〕×2—〔9430s—5830s—721min〕×2——〔9430s—5130s—721min〕×2—〔9430s—5030s—721min〕×20—725minstartpcr熱啟動(dòng)pcr是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，進(jìn)步pcr特異性最重要的方法之一。盡管taqdna聚合酶的最正確延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)展pcr反響配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)場(chǎng)，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于dna工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)pcr尤為有效。限制taqdna聚合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr反響液，并將其置于預(yù)熱的pcr儀。這種方法簡(jiǎn)單廉價(jià)，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種根本成分延遲dna合成，直到pcr儀到達(dá)變性溫度。包括延緩參加taqdna聚合酶，在反響體系到達(dá)90度時(shí)，pause，將溫度保持在70度以上，手工參加polymerase，但這個(gè)方法過(guò)于煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種根本成分，參加鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反響成分，如模板和緩沖液，物理地隔分開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。liwaxpcrgems(perkinelmer)taqbeadhotstartpolymerase(promega)magnesiumwaxbeads(stratagene).象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比擬煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactivednarase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。rpcr我們知道1ughumangenomicdna大約在3x105個(gè)模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當(dāng)模板的濃度過(guò)低,比方低于100個(gè)分子時(shí),引物和模板之間就很難發(fā)生反響.引物容易自身進(jìn)展反響形成二聚體.這樣就有來(lái)了個(gè)boosterpcr我一直找不到適宜的詞來(lái)翻譯這個(gè)booster.詳細(xì)是這樣的.開(kāi)場(chǎng)幾個(gè)cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molarratio在107~108.以確保開(kāi)場(chǎng)擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后boosteprimer的濃度到正常的程度8.循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度確定循環(huán)數(shù)的根本原理是:產(chǎn)物可以保證你進(jìn)一步分析^p操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)容易造成errors和非特異性產(chǎn)物的積累、產(chǎn)物的量不夠,優(yōu)化的方法有:1.增加template2.增加循環(huán)數(shù)如何確定循環(huán)數(shù),有一個(gè)方法.做一個(gè)pcr體系,40循環(huán),50ul,分別在20,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,一起跑電泳分析^p.從而確定最正確的循環(huán)數(shù)另一個(gè)會(huì)影響pcr特異性的是pcrcycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(ringrate).當(dāng)然是越高越好.不過(guò)咱們大部分條件有限,就那么幾臺(tái)pcr儀,也沒(méi)有多少挑選的余地lcyclerpcr儀的因素我們經(jīng)常容易無(wú)視.長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整pcr儀,以保證其可以到達(dá)正確的溫度.如今的pcr儀根本上都有自檢功能(self-diagnosis).additives附加物或者說(shuō)enhancer實(shí)在是多種多樣.根本上包括幾類(lèi),可以增加反響退火效率的化學(xué)因子,dna結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑.根本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯(cuò)配,增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量.在____rich情況中,additive可以造成配對(duì)堿基間的的不穩(wěn)定,從而進(jìn)步擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯(cuò)配的primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定,而進(jìn)步了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒(méi)有萬(wàn)能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradientpcr選擇最優(yōu)條件.======dimethylsulfoxide(dmso)upto10%formamideat5%trimethylammoniumchloride10-100umdetergentssuchastween200.1-2.5%polyethyleneglycol(peg)60005-15%glycerol10-15%singlestrandeddnabindingproteinsgene32protein1____single-strandeddnabindingprotein5um7deaza-dgtp(for____rich)150umwith50umdgtptaqextehder(stratagene)perfectmatchpcrenhancer(stratagene)q-solution(qiagen)======要注意的是,dmso,glycerol等會(huì)抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度tednapreparation提取dna時(shí)的試劑會(huì)抑制pcr反響的順利進(jìn)展.因此需要對(duì)templatedna進(jìn)展純化.特別是sds(<0.01%)的情況下就能強(qiáng)烈抑制pcr的進(jìn)展.可以參加一些nonionic試劑,如tween,nonid,trition之類(lèi)的反過(guò)來(lái)抑制sds.還有proteinasek也要除干凈,pcr簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,一對(duì)是長(zhǎng)的,一對(duì)是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的,用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.增加pcr的保真性高保真酶高溫dnapolymerase是以單鏈dna或rna為模板，在dntp和一些陽(yáng)離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成dna.包括3種類(lèi)型：a.5'-3'方向的dna合成才能,沒(méi)有3'-5'方向的外切酶特性.如taq及其突變體.這類(lèi)酶的合成才能強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變b.與a類(lèi)似,有合成活性,沒(méi)有3-5的外切活性.但他們能以rna為模板,合成dna.如tthdnapolymerasec.有dna聚合活性,沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfudnapolymerase.可以進(jìn)步忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taqdna聚合酶低。酶的混合物將taqdna聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)taqdna聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。其他因素除了酶，高濃度的dntp或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dntp的濃度從200μm降低到25-50μm可以增加準(zhǔn)確度假如四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)展較少的pcr循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷篇三pcr經(jīng)歷總結(jié)實(shí)驗(yàn)考前須知：〔1〕dna處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，防止反復(fù)使用造成污染?！?〕pcr操作應(yīng)戴手套并勤于更換，必要時(shí)應(yīng)戴好帽子和口罩，就像做手術(shù)一樣，要有“無(wú)菌觀(guān)念”?！?〕成套試劑，小量分裝，專(zhuān)一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理?！?〕試劑管用前先瞬時(shí)離心〔10s〕，使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器時(shí)機(jī)?！?〕最后加模板dna，馬上蓋好，混勻，瞬時(shí)離心〔10s〕，使水相與有機(jī)相分開(kāi)。參加模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板dna后應(yīng)更換手套?！?〕實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。還有諸如：移液槍用完要放到最大計(jì)量位置，防止久了彈簧失靈；防止rna酶污染標(biāo)本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個(gè)人防護(hù)；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯(cuò)試劑。問(wèn)題及解決方案匯總：一、假陰性，擴(kuò)增無(wú)條帶pcr反響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性④pcr循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)展分析^p研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)喪失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了缺點(diǎn)，因此要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析^p是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是pcr失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做pcr有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。mg2+濃度：mg2+離子濃度對(duì)pcr擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低pcr擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低那么影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反響體積的改變：通常進(jìn)展pcr擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)展pcr擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否那么容易失敗。物理原因：變性對(duì)pcr擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低pcr擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其pcr擴(kuò)增是不會(huì)成功的。二、假陽(yáng)性出現(xiàn)的pcr擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不適宜：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同性，因此在進(jìn)展pcr擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的穿插污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的穿插污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反響管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式pcr來(lái)減輕或消除。三、出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及pcr循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)的酶那么不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)進(jìn)步退火溫度或采用兩步法。四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶pcr擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dntp濃度過(guò)高，mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)的酶。②減少dntp的濃度。③適當(dāng)降低mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。五、出現(xiàn)大量引物二聚體1.從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的方法；2.可能模板有問(wèn)題；3.模板濃度過(guò)小，適當(dāng)加大模板量；酶，引物，mg2+濃度可能過(guò)高，可降低它們的濃度；5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再參加反響體系當(dāng)中，引物二聚體就會(huì)消失的；6.所配mix中加5%的甘油或者5%的dmso，可以增強(qiáng)特異性；反響體系的配制在冰上進(jìn)展，最后加taq酶，pcr完畢后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些taq酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。8.增加循環(huán)數(shù)；9.降低退火溫度后有條帶，那么應(yīng)逐漸進(jìn)步溫度，假設(shè)進(jìn)步溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，那么考慮增加鎂離子濃度〔根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度而定，片段長(zhǎng)那么相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些〕；10.假設(shè)降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mm沒(méi)有區(qū)別，那么考慮buffer等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致汲取的試劑濃度不對(duì)。11.以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr，可以進(jìn)步引物與模板的特異性，減少引物二聚體，假如兩次時(shí)間間隔短的話(huà)，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，假如間隔較長(zhǎng)可以稀釋50－100倍；六、高_(dá)___與復(fù)雜構(gòu)造的模板處理將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時(shí)冷卻，可大大降低二級(jí)構(gòu)造對(duì)pcr的影響。七、長(zhǎng)片段與短片段拼接失敗〔定點(diǎn)突變〕在做定點(diǎn)突變時(shí)，倘假設(shè)突變位點(diǎn)間隔基因的某一側(cè)較近〔短片段<200bp〕時(shí)，通常拼接困難或者難以通過(guò)電泳結(jié)果直觀(guān)判斷是否拼接成功。此時(shí)，可在短片段的上方〔突變近5’端〕或下方〔突變近3’端〕選取一條載體通用引物與基因另一條引物pcr〔控制產(chǎn)物大小》300bp〕，然后再做基因拼接。確認(rèn)大小無(wú)誤后，再以此產(chǎn)物為模板，用基因首尾引物pcr即可。八、longpcr無(wú)條帶對(duì)于》5kb片段擴(kuò)增，常規(guī)pcr很難得到較好的條帶，建議①更換更合適于longpcr的聚合酶；②添加pcrenhancer調(diào)整體系；③設(shè)計(jì)多對(duì)引物分段擴(kuò)增。pcr增強(qiáng)劑〔pcrenhancer〕：常見(jiàn)的添加劑有：dmso，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，bsa等，它們對(duì)pcr反響的影響雖然有所不同，但都可進(jìn)步pcr的擴(kuò)增效率。：解除模板dna部分二級(jí)構(gòu)造，增加引物與模板的特異性結(jié)合，使聚合酶更容易在二級(jí)構(gòu)造處延伸，但是對(duì)酶活有抑制作用，且當(dāng)其濃度大于10％時(shí)還會(huì)降低保真性。2.甘油：可降低模板溶解溫度〔tm〕，進(jìn)步產(chǎn)量，但是對(duì)酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進(jìn)某些“引物－模板”退火，降低帶有二級(jí)構(gòu)造的dna的變性溫度。4.硫酸銨：增加反響體系的離子強(qiáng)度，改變dna的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。5.甜菜堿：有利于dna雙鏈的解開(kāi)，polymerase的結(jié)合，進(jìn)步pcr的效率。檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷篇四高端pcr實(shí)驗(yàn)室控制設(shè)計(jì)說(shuō)明pcr實(shí)驗(yàn)室即分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在醫(yī)療、科研、生物技術(shù)方面得到廣泛的應(yīng)用。因其在不同行業(yè)的應(yīng)用各有區(qū)別，在詳細(xì)設(shè)計(jì)時(shí)也有不同之處，就醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設(shè)計(jì)，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴(kuò)增分析^p區(qū)；此類(lèi)三區(qū)設(shè)計(jì)時(shí)候應(yīng)用于類(lèi)似熒光定量型或同類(lèi)pcr分析^p設(shè)備，及擴(kuò)增與分析^p過(guò)程在設(shè)備內(nèi)一次完成。而四區(qū)設(shè)計(jì)在三區(qū)的根底上講擴(kuò)增分析^p區(qū)拆分為擴(kuò)增區(qū)與分析^p區(qū)適用于其他類(lèi)型的pcr設(shè)備及手工處理。在pcr實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)上，經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)歷累積，已經(jīng)在一些關(guān)鍵技術(shù)上達(dá)成了共識(shí)。因?yàn)閜cr實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的dna與rna片段過(guò)于微小，以致于可以穿透高效過(guò)濾器，所以在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)上已經(jīng)不在強(qiáng)迫要求設(shè)計(jì)高效凈化系統(tǒng)，但是為了進(jìn)步實(shí)驗(yàn)環(huán)境程度及保護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的敖貴設(shè)備方面，假如在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級(jí)別萬(wàn)級(jí)。在pcr實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的dna與rna片段污染是一直以來(lái)pcr實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)問(wèn)題。此類(lèi)污染主要至上次試驗(yàn)中所產(chǎn)生的基因片段對(duì)下次試驗(yàn)產(chǎn)生的污染，而且一旦試驗(yàn)環(huán)境中的污染形成后很難處理。因?yàn)橄镜葌鹘y(tǒng)方式對(duì)于基因污染沒(méi)有很良好的效果。所以在pcr實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中一般將整套實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)為全新風(fēng)型實(shí)驗(yàn)室，這樣而已通過(guò)有效的換氣次數(shù)來(lái)到達(dá)凈化室內(nèi)污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因?yàn)楦鲉挝粚?duì)pcr實(shí)驗(yàn)的重視程度各有不同，所以在設(shè)計(jì)上也有不同，主要的控制設(shè)計(jì)有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設(shè)備方面也有很多區(qū)分如壓力無(wú)關(guān)型控制系統(tǒng)、壓力有關(guān)型控制系統(tǒng)。根據(jù)業(yè)主要求，本pcr實(shí)驗(yàn)室為三區(qū)設(shè)計(jì)，各區(qū)可獨(dú)立使用，不設(shè)置高效過(guò)濾系統(tǒng)等相關(guān)要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設(shè)計(jì)方案為壓力無(wú)關(guān)型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點(diǎn)是，設(shè)備啟動(dòng)后可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用節(jié)點(diǎn)調(diào)節(jié)送風(fēng)量及排風(fēng)量來(lái)控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說(shuō)明見(jiàn)下列圖每個(gè)房間可分別控制，使用時(shí)通過(guò)房間開(kāi)關(guān)輸出啟動(dòng)信號(hào)，當(dāng)設(shè)備接到啟動(dòng)信號(hào)時(shí)設(shè)備運(yùn)行，運(yùn)行中根據(jù)管道壓力反響決定變頻器大小，房間內(nèi)送排風(fēng)量由壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)量調(diào)節(jié)閥控制。當(dāng)有多個(gè)房間開(kāi)啟或關(guān)閉時(shí)，設(shè)備更加管道壓力反響，調(diào)節(jié)設(shè)備變頻器增加或減少送排風(fēng)量來(lái)穩(wěn)定管道壓力。各房間內(nèi)壓力又房間內(nèi)的壓力無(wú)關(guān)型定風(fēng)量閥進(jìn)展控制。當(dāng)bsc〔生物平安柜，b2全排〕開(kāi)啟時(shí)bsc專(zhuān)用供風(fēng)機(jī)組運(yùn)行，bsc-供風(fēng)機(jī)-排風(fēng)機(jī)連鎖運(yùn)轉(zhuǎn)。當(dāng)bsc做變風(fēng)量調(diào)節(jié)時(shí)，根據(jù)房間內(nèi)壓力變化，bsc專(zhuān)用供風(fēng)機(jī)組前安裝的壓力無(wú)關(guān)型變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風(fēng)量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內(nèi)。當(dāng)房間不適用時(shí)，房間與緩沖間均關(guān)閉電動(dòng)密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)防止布朗運(yùn)動(dòng)造成的可能污染風(fēng)險(xiǎn)。房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，當(dāng)室內(nèi)污染發(fā)生時(shí)，通過(guò)一定時(shí)間的換氣處理后，污染問(wèn)題可以根本解決。本系統(tǒng)假如業(yè)主需要，可在室內(nèi)送風(fēng)口末端加裝高效過(guò)濾設(shè)備，房間可晉級(jí)為凈化型實(shí)驗(yàn)室。壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥簡(jiǎn)介：壓力無(wú)關(guān)型風(fēng)閥的特點(diǎn)是不會(huì)根據(jù)管道壓力的變化而影響風(fēng)閥內(nèi)部的送風(fēng)量，在一定管道壓力區(qū)間內(nèi)可以自行調(diào)節(jié)閥體阻力，來(lái)穩(wěn)定送風(fēng)量，是高端實(shí)驗(yàn)室必備的關(guān)鍵部件，目前此類(lèi)閥體技術(shù)均有國(guó)外消費(fèi)廠(chǎng)家控制，目前國(guó)內(nèi)主用使用的產(chǎn)品有妥思、文丘里、西門(mén)子等品牌。檢驗(yàn)科pcr工作經(jīng)歷篇五簡(jiǎn)介pcr實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。pcr是聚合酶鏈?zhǔn)椒错?polymerasechainreaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的dna片段，可看作生物體外的特殊dna復(fù)制。通過(guò)dna基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其準(zhǔn)確度高達(dá)納米級(jí)別，準(zhǔn)確檢測(cè)乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人最合適使用哪類(lèi)抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)根據(jù)條件1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的pcr熒光實(shí)驗(yàn)室;實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國(guó)appliedbiosystems公司推出由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它有特異性更強(qiáng)、有效解決pcr污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問(wèn)題作一介紹2、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)pcr熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;熒光定量pcr儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑+通用電腦+自動(dòng)分析^p軟件，構(gòu)成pcr-dna/rna實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。3、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;4、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并獲得合格證書(shū);pcr實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國(guó)家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。pcr實(shí)驗(yàn)室通過(guò)驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”。pcr實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序〔sop〕、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生平安，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行5、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)展操作功能可以對(duì)患者病情進(jìn)展科學(xué)、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的掌控，并結(jié)合抗hbv與t細(xì)胞免疫來(lái)打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學(xué)難題，能迅速消除臨床病癥，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長(zhǎng)期保護(hù)，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程。建立方法1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT(mén)用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴pcr產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)