微量染鎘對孕鼠睪丸分化發(fā)育的影響及作用機(jī)制

微量染鎘對孕鼠睪丸分化發(fā)育的影響及作用機(jī)制

鎘（cd）是環(huán)境中的普遍存在的重金屬。通常，在飲用水、食品、空氣和土壤中檢測到輕微的鎘含量。鎘污染在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，對人類健康構(gòu)成威脅。以往人們多從有毒重金屬的角度研究Cd對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用。近年實(shí)驗(yàn)研究提示Cd亦是一種潛在的非類固醇類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,具有一定的雌激素樣效應(yīng)。而鎘的雌激素樣作用是否影響雄性生殖系統(tǒng)的分化發(fā)育過程及作用機(jī)制尚待深入研究證實(shí)。本研究在我們前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)敏感的窗口時期(妊娠期染Cd模型),并采用雌激素和雌激素受體拮抗劑干預(yù)作比較研究,進(jìn)一步探討微量鎘暴露對雄性胎鼠性腺發(fā)育的影響及可能的內(nèi)分泌干擾機(jī)制。1材料和方法1.1u3000試劑SPF級性成熟SD大鼠,體重240～260g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供.合格證號:SCXK(渝)20070001。氯化鎘(天津市東麗區(qū)東大化工廠,批號2000118,分析純,純度為99%)。兔抗大鼠StAR抗體(美國santa公司),SABC試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TrizolReagent(invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(TOYOBO生物科技有限公司公司)。Olympus解剖顯微鏡及OlympusDP70圖像采集系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)。Hitachi-7500型透射電鏡(日本日立公司)。熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)。1.2動物飼養(yǎng)及沉浮物的制備按雄、雌性2:1比例,將SD大鼠于18:00合籠交配過夜,以次晨雌鼠出現(xiàn)陰道栓作為受孕標(biāo)志,記為妊娠第0天(GD0)。未受孕鼠于次日18:00再與雄鼠合籠,2周未孕者放棄。共得孕鼠16只,隨機(jī)分為4組,每組4只。動物飼養(yǎng)溫度為(20至24)℃,相對濕度為(60±5)%,保持飼養(yǎng)環(huán)境條件恒定。A組于孕期第9、11、13天腹腔注射氯化鎘1.5mg/(kg.d),B組于妊娠第9至17天皮下注射己烯雌酚100ug/(kg.d),C組注射氯化鎘的同時給予雌激素受體拮抗劑他莫昔酚50mg/(kg.d),D組注射與鎘等體積生理鹽水。鎘染毒劑量及干預(yù)時間參考Holt等研究結(jié)果。于GD18天將孕鼠頸椎脫臼,剖腹取出胎鼠,取雄性胎鼠做相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。1.3常規(guī)乙醇脫水、石蠟色液染色在解剖顯微鏡下快速取出雄性胎鼠睪丸放進(jìn)固定液(苦味酸:甲醛:冰醋酸,體積比為15:5:1)中固定后,常規(guī)乙醇脫水,石蠟包埋,切片,HE染色后光鏡下觀察。1.4利用乙醇和丙酮梯度脫水法迅速取出雄性胎鼠睪丸,經(jīng)4%戊二醛預(yù)固定,1%鋨酸后固定(pH=7.2至7.4)后,用乙醇和丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合,超薄切片,然后經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色。在H-7500型透射電鏡下觀察胎睪超微結(jié)構(gòu)。1.5胎鼠睪丸的熱血藥濃度觀察與組成測定胎鼠睪丸石蠟切片用二甲苯脫蠟共40min,梯度乙醇脫苯各4min,PBS沖洗3次;枸櫞酸鹽熱修復(fù)20min,自然冷卻后PBS沖洗;3%H2O2室溫孵育10min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,PBS充分洗滌;正常山羊血清封閉在37℃恒溫箱中30min;傾去血清,滴加1:200兔抗大鼠StAR一抗,40C濕盒過夜;37℃恒溫水浴箱中1h后PBS沖洗,加入二抗,37℃恒溫水浴箱中l(wèi)h;PBS浸洗后,加SABC置于37℃恒溫箱中30min。PBS洗3次,DAB顯色1-3min,最后蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。陰性對照組,用PBS代替一抗,其他處理過程一致。收集各組胎鼠睪丸的StAR免疫組化切片.每組計(jì)數(shù)10只胎鼠切片,每張切片用OlympusDP70圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)采集10個視野,共計(jì)4組400張照片。用北航CM-2000B生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對所攝照片的陽性產(chǎn)物進(jìn)行平均光密度(OD)值分析。1.6misrtplr方法1.6.1提取的內(nèi)部用TRIzol試劑一步法提取睪丸組織總RNA。1.6.2na序列及分析根據(jù)Genebank中SD大鼠的RNA序列,用Primer25引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì),具體序列見表1。由Invitrogen中國公司合成。1.6.3反應(yīng)體系及引物合成采用Sybrgreen染料法,按照試劑說明書配好反應(yīng)體系,將每個樣本重復(fù)3次。反應(yīng)體系(共20μl):2×SYBRqPCRmix12.5μl,引物2μl,DNA模板2μl,dH208.5μl。反應(yīng)條件:95℃1min,95℃15s,58℃20min,72℃45min,循環(huán)40次。1.6.4基因表達(dá)量及ct值的計(jì)算以β-actin為內(nèi)標(biāo)基因,對比MIS基因的擴(kuò)增效率。目的基因的表達(dá)量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)標(biāo)基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)標(biāo)基因)對照組,2-ΔΔCT表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)。1.7兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較所有數(shù)據(jù)用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,利用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1鎘對生殖母細(xì)胞的影響正常對照組妊娠18天胚胎睪丸中已出現(xiàn)許多初期的生精小管,可見單層支持細(xì)胞排列整齊并緊貼于基底膜,生精小管管腔內(nèi)可見較圓的生殖母細(xì)胞,管周可見薄層成纖維細(xì)胞,生精小管間疏松的結(jié)締組織中可見散在或成群分布的間質(zhì)細(xì)胞(圖1D)。鎘組和己烯雌酚組生精小管內(nèi)支持細(xì)胞及生殖母細(xì)胞排列紊亂,部分管腔內(nèi)呈現(xiàn)團(tuán)塊狀堆積的支持細(xì)胞,生殖母細(xì)胞減少或無,間質(zhì)成纖維細(xì)胞和膠原纖維異常增生(圖1A、1B)。而鎘加他莫昔酚組的改變較輕(圖1C)。2.2鎘對間質(zhì)細(xì)胞的抑制作用電鏡下,正常組胎鼠睪丸生精小管內(nèi)以立方或矮柱狀的未成熟型支持細(xì)胞為主,核卵圓形,齒形凹陷少而淺,核仁致密,胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器稀少;生殖母細(xì)胞體積較大,數(shù)量少,胞質(zhì)內(nèi)含有較多的游離核糖體,線粒體呈圓形,嵴少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不豐富。間質(zhì)細(xì)胞成群分布于生精小管間,胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體豐富,并見適量脂滴(圖2A、2B)。鎘組和己烯雌酚組支持細(xì)胞、生殖母細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均見線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,受損嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)可見線粒體嵴減少、斷裂,溶酶體增多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛擴(kuò)張,髓樣結(jié)構(gòu)形成,間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)較多脂滴堆積,偶見間質(zhì)細(xì)胞凋亡(圖2C、2D、2E)。鎘加他莫昔酚組的超微結(jié)構(gòu)損傷程度較輕(圖2F)。2.3國際單次給藥劑對st陽性產(chǎn)物表達(dá)的影響StAR陽性產(chǎn)物呈棕黃色,在生精小管之間的間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中特異性地表達(dá)。正常對照妊娠18天的雄性胎鼠睪丸組織中,陽性產(chǎn)物呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖3D)。鎘組、己烯雌酚組和鎘加他莫昔酚組間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中StAR陽性產(chǎn)物表達(dá)情況詳見圖3A、3B、3C。陰性對照組無特異性染色。統(tǒng)計(jì)分析顯示,鎘組(0.258±0.011)和己烯雌酚組(0.262±0.013)StAR陽性產(chǎn)物的OD值均明顯低于正常對照組(0.513±0.018),經(jīng)方差分析和SNK檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10,P<0.01);鎘加他莫昔酚組(0.407±0.016)StAR陽性產(chǎn)物的0D值雖然也低于正常對照組,但是其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10,P>0.05)。同時鎘加他莫昔芬組StAR陽性產(chǎn)物的OD值高于鎘組經(jīng)方差分析和SNK檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10,P<0.05)。2.4胎大鼠睪丸mis結(jié)果見表2。四個組胎鼠睪丸中MIS表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3鎘對胎鼠睪丸中mis表達(dá)的影響近年研究表明,半個世紀(jì)以來世界范圍內(nèi)男性的精子數(shù)量下降了50%,隱睪、尿道下裂、睪丸腫瘤、前列腺癌等生殖道疾病發(fā)生率增加了1倍,不育癥發(fā)生率也有增加的趨勢,男性生殖系統(tǒng)畸形發(fā)生率增加與孕婦及胎兒的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露因素有關(guān)。鎘作為一種潛在的非類固醇類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,具有雌激素作用。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用的敏感窗口期對大鼠進(jìn)行染Cd,干預(yù)劑量及時間參考Holt和Emmen等的研究,同時增加己烯雌酚組與鎘加雌激素受體拮抗劑他莫昔酚組作對比研究。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)鎘組胎鼠睪丸組織形態(tài)發(fā)生明顯改變,電鏡下胎鼠睪丸支持細(xì)胞核和線粒體腫脹,髓樣結(jié)構(gòu)形成,并見較多脂滴堆積于間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。間質(zhì)細(xì)胞為合成、分泌雄激素睪酮的主要場所,機(jī)體90%以上的睪酮由其分泌,在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育中,睪酮刺激華氏管發(fā)育成附睪、輸精管、前列腺和精囊,并最終使雄性性腺睪丸發(fā)育成熟。間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的退變及隨后的功能障礙勢必引起雄性性腺分化發(fā)育的異常。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)是膽固醇的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要參與膽固醇的代謝,合成類固醇激素。激素合成時,游離膽固醇需經(jīng)線粒體外膜轉(zhuǎn)在類固醇激素生成組織中,類固醇激素合成信號使StAR迅速在睪丸組織中表達(dá),StAR蛋白可能參與膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),介導(dǎo)并促進(jìn)膽固醇經(jīng)線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜,繼而在P450scc的作用下發(fā)生羥化和側(cè)鏈裂解生成孕烯醇酮,最后在有關(guān)的類固醇激素合成酶的作用下逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮和其他類固醇,該步驟是睪酮合成的限速步驟。本研究結(jié)果顯示,鎘組胎鼠睪丸StAR陽性產(chǎn)物表達(dá)下降。鎘除了使StAR蛋白表達(dá)下降外,還可引起胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞P450scc以及成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞G-6-Pase活性下降,這些關(guān)鍵酶的活性下降將導(dǎo)致睪酮合成受阻繼而出現(xiàn)雄性性腺分化發(fā)育異常。此外,本研究電鏡觀察在鎘組和己烯雌酚組的胎睪中常見較多巨噬細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子和活性氧物質(zhì)(ROS)等炎癥介質(zhì),ROS能與一些生物大分子結(jié)合,如與脂類、蛋白質(zhì)等結(jié)合,并對這些大分子進(jìn)行化學(xué)修飾,使其失去生物活性。Hales等認(rèn)為巨噬細(xì)胞分泌的ROS可通過對間質(zhì)細(xì)胞線粒體的干擾,抑制StAR蛋白的表達(dá),從而調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)雄激素的合成。故我們推測鎘組和己烯雌酚組StAR陽性產(chǎn)物的表達(dá)下降,除了鎘和己烯雌酚的直接作用外,可能還與他們影響巨噬細(xì)胞的功能有關(guān)。MIS是一種同源二聚體糖蛋白,其相對分子量為140KD,由胎兒的睪丸支持細(xì)胞以及成體的睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌。MIS既可作為自分泌和旁分泌因子在局部發(fā)揮作用,也可以作為激素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮對其它靶細(xì)胞的作用。在睪丸中,MIS能夠促使誘導(dǎo)苗勒氏管退化,使泌尿生殖系統(tǒng)向雄性發(fā)展,同時也能夠抑制間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的增殖,因此在雄性生殖系統(tǒng)分化發(fā)育中起著重要作用。但本研究通過RT-PCR方法檢測,結(jié)果顯示四個組胎鼠睪丸組織中MIS表達(dá)均無明顯差異(P>0.05),提示孕期微量染鎘對雄性胎鼠性腺分化發(fā)育的影響可能并不是通過鎘致MIS改變的途徑。實(shí)驗(yàn)中鎘組和己烯雌酚組