創(chuàng)傷性凝血障礙中miR-24的增高對FX生成的影響及意義

創(chuàng)傷性凝血障礙中miR-24的增高對FX生成的影響及意義研究背景創(chuàng)傷性凝血障礙(TIC)的患者凝血因子不足的機(jī)制尚未明確。微小RNA(miRNA)或許參與了TIC的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在探討miRNA-24-3p(miR-24)在創(chuàng)傷和TIC患者中的表達(dá)水平和它在凝血因子不足中發(fā)揮的作用。方法本研究納入15名健康志愿者和36名重癥創(chuàng)傷的患者(創(chuàng)傷嚴(yán)重程度評分(ISS)≥16),創(chuàng)傷患者中包括了28名非TIC和8名TIC患者。TIC的定義為患者來急診就診時(shí)的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)>1.5。收集患者就診當(dāng)時(shí)和第3天的血液標(biāo)本。采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)方法確定血漿中miR?24的表達(dá)。用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血漿中凝血因子X(FX)和凝血因子XII(FXII)的濃度。采用多因素Logistic回歸分析、相關(guān)性分析等方法分析各資料數(shù)值間的相關(guān)性。結(jié)果在重癥創(chuàng)傷患者中,血漿miR-24的表達(dá)增高了3.17倍(P=0.043),3天后顯著下降(P<0.01)。TIC患者的miR-24表達(dá)顯著高于非TIC患者(P=0.040)。多因素Logistic回歸分析提示高miR-24表達(dá)與TIC有關(guān)。TIC患者中血漿FX濃度較非TIC患者(P=0.030)和正常對照患者(P<0.01)顯著下降。相關(guān)性分析提示患者血漿FX含量同休克指數(shù)、ISS、INR、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間和白蛋白存在中等到強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性;同血紅蛋白存在中等的正相關(guān)性。miR-24的表達(dá)和FX的水平呈負(fù)相關(guān)性,同F(xiàn)XII的水平的相關(guān)性不顯著。結(jié)論在創(chuàng)傷和TIC患者中,血漿miR-24表達(dá)水平顯著上調(diào)。FX的水平跟許多臨床指標(biāo)相關(guān)。miR-24和FX的負(fù)相關(guān)性提示了miR-24或許能夠通過抑制FX的生成參與TIC的發(fā)生。本研究為TIC發(fā)病機(jī)制的解釋提供了一個(gè)新的視角。同時(shí)也為TIC的診斷和治療提供了一個(gè)可能的方式。研究背景探討miR-24是否能在體外抑制FX的生成。方法體外培養(yǎng)L02人正常肝細(xì)胞,脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-24轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞。qRT-PCR測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-24表達(dá)水平,MTT法測定過表達(dá)miR-24對L02細(xì)胞增殖的影響,qRT-PCR和Westernblot法測定miR-24轉(zhuǎn)染后L02細(xì)胞中HNF-4αmRNA和蛋白的變化,ELISA法測定L02細(xì)胞上清液中FX的濃度。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-24mimic24h后,L02細(xì)胞中miR-24的表達(dá)較正常對照組和NC組表達(dá)增高約48倍;3組的細(xì)胞增殖能力無明顯差異(P>0.05);對比正常對照組,miR-24轉(zhuǎn)染后L02細(xì)胞中HNF-4α的mRNA表達(dá)約下降34.3%(P=0.023),HNF-4α蛋白含量約下降44.2%(P=0.013);miR-24轉(zhuǎn)染后FX在L02細(xì)胞上清液中的水平顯著減少,從(55.38±5.78)ng/mL降至(43.30±8.49)ng/mL(P=0.030)。結(jié)論miR-24能夠抑制L02細(xì)胞中FX的生成。本研究進(jìn)一步明確了miRNA在凝血因子生成中發(fā)揮的作用。研究背景對于需大量輸血(MT)的創(chuàng)傷患者,理想的新鮮冰凍血漿(FFP)和紅細(xì)胞(RBC)的輸注比例尚未明確。本部分研究旨在探討比較不同比例的輸血策略(FFP:RBC為1:1和1:2.5)對于創(chuàng)傷-失血性休克(T-HS)大鼠的復(fù)蘇效果,及對血漿miR-24和肝臟FXmRNA表達(dá)的影響。方法計(jì)算第一部分納入的MT創(chuàng)傷患者輸注FFP:RBC比例。26只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、乳酸林格氏液復(fù)蘇組(B組)、FFP:RBC1:1輸血復(fù)蘇組(C組)和FFP:RBC1:2.5輸血復(fù)蘇組(D組),另25只雄性SD大鼠用做血液采集。制作T-HS模型后,模型組予以預(yù)先設(shè)置的液體復(fù)蘇干預(yù),維持大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)≥80mmHg。觀察并記錄4組實(shí)驗(yàn)大鼠的MAP、死亡率及復(fù)蘇液體用量。復(fù)蘇后所有大鼠觀察2h后處死,處死前抽取所有大鼠的動(dòng)脈血液,行凝血和血?dú)夥治?。qRT-PCR檢測血漿中miR-24含量。取大鼠肝臟組織,qRT-PCR檢測FXmRNA水平。結(jié)果本組9名MT患者輸注FFP:RBC約為1:2.5。成功制備大鼠T-HS模型,4個(gè)組間的體重和初始MAP、3個(gè)模型組間的出血量無顯著差異(P>0.05);B組大鼠死亡率顯著高于兩個(gè)成分輸血組(P<0.01);復(fù)蘇后B組大鼠MAP在T180和T210時(shí)間點(diǎn)較C組和D組顯著降低(P<0.05),實(shí)驗(yàn)過程中C組和D組的MAP無顯著差異;血?dú)夥治鎏崾?組成分輸血組的酸中毒與血氧分壓的下降的程度較B組有顯著改善,各項(xiàng)血?dú)庵翟贑組和D組中比較均無顯著差異(P>0.05)。為維持大鼠血壓于80mmHg以上,C組需要的用血量顯著高于D組(P<0.01)。觀察期結(jié)束后,B組大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的凝血障礙,FFP:RBC1:1比例復(fù)蘇能使T-HS后大鼠凝血指標(biāo)恢復(fù)正常,較Sham組無顯著差異(P>0.05)。D組的凝血指標(biāo)則顯著高于C組和A組(P<0.05)。B組大鼠血漿miR-24相對表達(dá)量為A組的2.59倍,1:1輸血組miR-24的表達(dá)較D組降低更為顯著(P=0.03),同A組無顯著差異(P=0.70);B組大鼠肝臟FXmRNA的表達(dá)水平較A組降低至42.5%,C組大鼠肝臟FXmRNA的表達(dá)較D組顯著增高(P<0.01),與A組無顯著差異(P=0.67)。Pearson’s相關(guān)性分析顯示實(shí)驗(yàn)大鼠血漿miR-24與肝臟FXmRNA的表達(dá)