胃癌患者胃液中特異性熒光物質初步確定

胃癌患者胃液中特異性熒光物質初步確定

1整理ppt研究背景1990年,我中心開始致力于通過檢測血清和胃液的熒光光譜來診斷胃癌的系列研究。先后利用288nm紫外光作為激發(fā)光,對500例各種胃內疾患患者的胃液進行高效液相熒光光譜檢測,發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液中存在兩種特異性熒光物質,其含量較胃內良性病變明顯增多。2整理ppt研究背景在上述實驗的根底上,我們試圖通過聯(lián)合使用高效液相及質譜技術分析高效液相熒光光譜中保存時間為11.5～12.5min的熒光物質成分,從而對良惡性胃病患者胃液高效液相熒光光譜差異的物質進行初步分析。3整理ppt研究目的從胃癌患者胃液中發(fā)現(xiàn)特異性熒光物質,并以此來獲得腫瘤標志物。4整理ppt研究方法收集10例胃癌患者與10例非胃癌患者的胃液,濃縮后行高效液相分析,并收集高效液相熒光光譜中保存時間為11.5～12.5min的熒光物質;再經(jīng)質譜鑒定,所得結果與L-色氨酸的質譜比較,最終確定這種熒光物質的主要組分。5整理ppt研究結果在高效液相的熒光光譜保存時間為11.5～12.5min時,胃癌患者胃液中有特異性熒光物質,其含量較其他胃內良性病變患者明顯增多。6整理ppt胃良、惡性病變患者濃縮胃液的高效液相熒光光譜7整理ppt研究結果空白對照的一級質譜圖中有共同質荷比為279及288的峰;10例胃癌患者的一級質譜圖中,均出現(xiàn)質荷比為205,217,279,288,404,790及811的峰,有些還出現(xiàn)409。而10例胃內良性病變患者的一級質譜圖中,均出現(xiàn)質荷比為279,404,790及811的峰。8整理ppt胃良、惡性病變患者胃液熒光峰收集樣品的一級質譜圖2172059整理ppt研究結果推測胃癌患者胃液中含量較多的特殊熒光物質可能對應的是質荷比為205及217的峰。經(jīng)質譜鑒定后顯示,胃癌患者胃液中質荷比為205的物質與L-色氨酸的三級質譜完全一致,證實該物質為L-色氨酸〔L-tryptophan〕。10整理ppt討論近年來經(jīng)大量研究證實,機體內存在許多內源性熒光物質,它們形成的綜合熒光光譜,在良性病變及腫瘤患者之間確實存在差異。而體液是腫瘤發(fā)生、演進及轉移的內環(huán)境,腫瘤生長過程中分泌及代謝產(chǎn)物會直接影響體液的組成。對體液進行熒光檢測,有可能發(fā)現(xiàn)良惡性之間的差異。11整理ppt討論在本實驗條件下,對應著高效液相保存時間為3.5～4.5min及11.5～12.5min的兩種物質,利用高效液相技術,可以將胃液中保存時間在11.5～12.5min的特異性熒光成分別離出來,減少其他物質的干擾,并可進一步行質譜分析。12整理ppt討論比照實驗中,從胃癌及胃內良性病變患者的質譜圖發(fā)現(xiàn),兩者均為混合物。證實在液相保存時間為11.5～12.5min的收集物中,同時存在熒光及無熒光的物質。而胃癌患者獨有質荷比為205及217的峰。據(jù)此推測,胃癌患者特異性熒光物質的相對分子質量可能為204或216。13整理ppt討論L-色氨酸是一種重要的可產(chǎn)生熒光的芳香氨基酸。其相對分子質量為204.2,本實驗證實,它與胃癌特異性熒光物質之一的保存時間一致。與質荷比為205物質的一、二及三級質譜的圖形完全一致?？梢钥隙?L-色氨酸是胃癌患者胃液中特異性熒光物質的組成成分。14整理ppt討論質荷比為217的物質也有可能參與熒光峰的形成。且其二級及三級質譜與L-色氨酸一致。故疑心它為一種與L-色氨酸相類似的物質,其實際相對分子質量為216。但因缺乏與本質譜配套的解析標準譜庫,目前無法進一步搞清其結構。15整理ppt討論對質譜圖中其他峰代表的物質,也還應明確其結構及熒光特性。對高效液相保存時間在3.5～4.5min的物質,尚有待進一步確認。16整理ppt結論本實驗嘗試聯(lián)合使用高效液相和質譜技術來分析胃液中一種腫瘤標志物的方法。對新的胃癌腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)起鋪墊作用,具有廣泛的應用前景。對揭示腫瘤發(fā)生、演進及代謝的生化過程有可能起關鍵作用。17整理ppt李淵,林三仁,周麗雅,彭嘉柔,郭慧蘭.胃癌患者胃液中特異性熒光物質的初步確定[J].中華消化雜志,2003,01:11-14.18整理pptThree

aromaticaminoacids

in

gastricjuice

aspotentialbiomarkersfor

gastric

malignancies19整理pptBACKGROUNDForscreeningearly-stage

gastric

malignancies,theexistingserumbiomarkershavelimitedsensitivityandspecificity.

Gastricjuice

biomarkersarescarceandrequirefurtherinvestigation.20整理ppt研究背景對于篩查早期胃惡性腫瘤，現(xiàn)存的血清學生物標志物在敏感性和特異性方面都有其局限性。胃液生物標志物稀缺，需要進一步調查。21整理pptOBJECTIVEWedividedthisstudyonsearchingpotentialbiomarkersintofourparts:(1)detectionofdifferentialspectroscopyandHPLC,(2)identificationandvalidationofdifferentialpeaksusingLC/MSandNMR,(3)quantificationofpotentialbiomarkers,and(4)establishmentofdiagnosticdetection.

22整理ppt研究目的我們將這個篩選潛在的生物標記物的研究分為四個局部：〔1〕聯(lián)合使用熒光光譜和高效液相色譜法檢測良惡性胃病患者胃液熒光光譜；〔2〕使用液相/質譜和核磁共振的方法來識別和驗證良惡性胃病患者胃液熒光光譜的區(qū)別；〔3〕定量研究潛在的生物標記物；〔4〕建立診斷檢測。23整理pptMETHODSInthisstudy,discriminatingfluorescencebiomarkerswereisolatedandidentifiedfromgastricjuicebyusinghigh-performanceliquidchromatography(HPLC)andliquidchromatography/massspectrometry(LC/MS),andvalidatedusingnuclearmagneticresonance(NMR).24整理ppt研究方法本研究中應用高效液相(HPLC)，液相/質譜〔LC/MS〕的方法，別離并識別差異的胃液熒光標志物，并且用核磁共振〔NMR〕的方法進行了驗證。25整理pptRESULTSThefluorescencespectroscopyofdilutedgastricjuiceindicatesthattheFIofP1frompatientswithgastricmalignancieswassignificantlydifferentfromthatinpatientswithbenigngastriclesions(Fig.1aandb).26整理ppt研究結果稀釋胃液固有熒光光譜說明，胃惡性腫瘤患者FIP1與胃良性病變者明顯不同〔圖1A，B〕。27整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.圖1熒光標志物的發(fā)現(xiàn)Fluorescenceemissionspectra(excitationat288nm)ofdilutedgastricjuicefromthebenign(a)andmalignant(b)groups.稀釋胃液的熒光激發(fā)光譜(激發(fā)光波長為288納米)，良性(a)和惡性(b)組。28整理pptRESULTSHPLCwasusedforthediscoveryofvaluablebiomarkersinthegastricjuice.ThechromatogramsareshowninFig.1c–f.Bycomparingthechromatogramsforthebenignandmalignantgroups,thediscriminatingbiomarkerscouldbeassociatedwithpeaksI,II,IIIandIV,whichwereelutedaround8,12,16.5and33min,respectively.29整理ppt研究結果采用高效液相色譜法測定胃液中有價值的生物標志物。色譜圖如圖1c–f所示。對良性組和惡性組色譜圖進行比較，有助于鑒別I，II，III和IV相關峰的生物標志物，它們的洗脫時間分別約為8，12，16.5和33分鐘。30整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.圖1熒光標志物的發(fā)現(xiàn)Fluorescencechromatograms(λex=288nm,λem=360nm)ofgastricjuicefrombenign(c)andmalignant(d)groups.稀釋胃液的熒光質譜圖(激發(fā)光波長為288納米，發(fā)射光波長為360納米)，良性(c)和惡性(d)組。31整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.圖1熒光標志物的發(fā)現(xiàn)UVchromatograms(λ=205nm)ofgastricjuicefrombenign(e)andmalignant(f)groups.稀釋胃液的紫外質譜圖(激發(fā)光波長為205納米)，良性(e)和惡性(f)組。32整理ppt33整理ppt34整理pptRESULTSThefluorescenceintensity(FI),tyrosine,phenylalanine,tryptophanandtotalproteincontentweresignificantlyhigherinthe

gastricjuice

ofpatientswith

gastricmalignancies(allP<0.01).35整理ppt研究結果胃惡性腫瘤患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的熒光強度(FI)和血清總蛋白含量明顯高于胃良性病變患者(P值均<0.01)。36整理pptFig.2.(a)Scatterplotindicatesvaluesoftyrosine,phenylalanine,tryptophan,totalproteinandFIingastricjuicefrombenignandmalignantgroups.圖2〔a〕散點圖顯示良性和惡性病變組患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、總蛋白和熒光強度〔FI〕值。37整理pptRESULTSWithallP<0.001,theareasunderthereceiveroperatingcharacteristiccurvesofthebiomarkersweretyrosine,0.838;phenylalanine,0.856;andtryptophan,0.816.Ataspecificityof79.4%,thesensitivityfor

gastric

malignancydetectionwithphenylalanine

was87.9%only.38整理ppt研究結果在所有P<0.001的生物標志物中,受試者工作特征曲線〔ROC〕下面積分別是:酪氨酸,0.838;苯丙氨酸,0.856;色氨酸,0.816。在特異性為79.4%時，苯丙氨酸用于胃惡性腫瘤檢測的靈敏度為87.9%。39整理pptFig.2.(b)ROCcurvesfordetectionofgastricmalignancieswereplottedwiththeuseoftyrosine(Tyr),phenylalanine(Phe),tryptophan(Trp),proteinandFI.圖2〔b〕使用酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),總蛋白和熒光強度〔FI〕繪制的受試者工作特征〔ROC〕曲線用于檢測胃惡性腫瘤。40整理pptDISCUSSIONSTheelevationofaromaticaminoacidsingastricjuicemaybeexplainedasfollows.First,malignantcellsareextremelyinvasive,andtheycansynthesizeandsecretemanyenzymes(e.g.,matrixmetalloproteinases,MMPandproteinases)thatcoulddegradethebasementmembraneandextracellularmatrix.41整理ppt討論胃液芳香族氨基酸升高的機制如下：首先，惡性細胞的侵襲性極強，它們可以合成并分泌許多酶類〔例如，金屬基質蛋白酶MMP和蛋白酶〕降解基底膜和細胞外基質。42整理pptDISCUSSIONSCollagenfibersandelastincontainendogenousfluorophores(aromaticaminoacidresidues),whichhavefluorescenceproperties,andarerichinthebasementmembraneandtheextracellularmatrix.Therefore,theelevationofaromaticaminoacidsingastricjuicemightbeaphenomenonthatresultsfromdegradationofbasementmembraneandextracellularmatrix.43整理ppt討論膠質纖維和彈性蛋白包括內源性熒光物質〔氨基酸殘留物〕，在細胞基底膜和細胞外基質的含量豐富。因此，胃液氨基酸含量的升高可能預示著基底膜和細胞外基質的降解。44整理pptDISCUSSIONSSecond,duetoincreasedproteinsynthesisandrapidgrowth,moreessentialaminoacids(especiallyforaromaticaminoacids)maybeup-regulatedinmalignanttissue.Somecellsshowexfoliationornecrosisandreleasecytoplasmenrichedwithessentialaminoacids,whichcouldenhancethearomaticaminoacidslevelsingastricjuices.

45整理ppt討論第二，因為惡變組織蛋白質合成增加，生長加快，所以需要上調必須氨基酸〔尤其是芳香族氨基酸〕的表達。一些脫落或壞死的細胞釋放必需氨基酸含量豐富的細胞基質，可以提高胃液芳香族氨基酸的水平。46整理pptDISCUSSIONSThird,excessreactiveoxygenspecies(ROS)producedduringchronicimmuneactivationaroundtumortissuemayinterrupttheconversionofphenylalaninetotyrosine.Hence,thephenylalanineconcentrationincreases.Moreover,amino-acid-metabolizingenzymes(e.g.,indoleamine2,3-dioxygenaseandmonoamineoxidase)thatareexpressedaberrantlyinmalignantcells,mayaffectthearomaticaminoacidslevelsingastricjuice.

47