蛋白激酶抑制劑H89和漢防己甲素協(xié)同抗腫瘤作用研究

蛋白激酶抑制劑H89和漢防己甲素協(xié)同抗腫瘤作用研究癌癥是由于細胞持續(xù)增殖與異常分化,導致細胞在體內(nèi)不受控制的生長和擴散引起的惡性疾病。雖然過去的幾十年里,人們對癌癥的研究取得了巨大的進步,但是癌癥依然成為威脅人類健康的第二大死亡原因。癌癥是一種多因素控制的復雜的疾病,因此癌癥的治療也非常困難。目前臨床上對于癌癥的治療方法有很多,化學療法是治療癌癥的主要方法,尤其對中晚期的癌癥病人或者白血病患者。因此化療藥物的開發(fā)對于癌癥的治療非常重要,據(jù)統(tǒng)計目前經(jīng)FDA批準的200多中化療藥物中,很多來源于天然產(chǎn)物或其衍生物。漢防己甲素提取于防己科植物StephaniatetrandraS.Moor的根部,屬于雙芐基異喹啉生物堿。漢防己甲素在細胞內(nèi)有很多生理功能,包括抑制鈣離子通道、抗炎、免疫抑制劑、抗過敏和抗埃博拉病毒等。漢防己甲素片在臨床上用于治療關(guān)節(jié)炎,高血壓,炎癥和矽肺等疾病。近年來,我們實驗室和其他研究者都表明漢防己甲素是一種潛在的抗腫瘤藥物,對很多種癌癥都表現(xiàn)出抗癌活性,并且有希望進入臨床試驗。由于腫瘤細胞的異質(zhì)性特征,任何一種有效的化療藥物,在癌癥長期治療的過程中都會產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性的耐藥性。雙藥聯(lián)合治療策略有多藥物,多靶點的特點?？梢詤f(xié)同增加治療效率,降低單藥濃度降低副作用,縮小或減緩耐藥性的產(chǎn)生。值得注意的是,漢防己甲素和其他的化療藥物聯(lián)合時,能產(chǎn)生明顯增強的抗腫瘤效果。H89屬于異喹啉磺胺類化合物,是PKA抑制劑,在體內(nèi)或體外有很強的活性。有研究證明H89在高濃度時能抑制細胞的增殖,誘導細胞凋亡,誘導細胞自噬。H89還可以抑制細胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道和Kv1.3鉀離子通道。近兩年的研究表明,H89具有化療增敏作用。與其他化療藥物聯(lián)合時,能增強其他藥物的抗癌作用。比如與三硝酸甘油酯、假單胞菌毒素HA22、溶瘤病毒等聯(lián)合,產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤效果,但是H89與天然產(chǎn)物類藥物的聯(lián)合作用尚未見報道。因此本論文我們重點開展了蛋白激酶抑制劑H89和漢防己甲素聯(lián)合對人類癌癥的治療作用的研究。我們設計了大量濃度梯度組合,作用于人類多種腫瘤細胞,包括乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、腎癌,計算細胞活力,用藥物協(xié)同軟件CompuSyn分析得出抑制效應和聯(lián)合指數(shù)(Fa-CI)曲線。分析結(jié)果表明,漢防己甲素和H89聯(lián)合對腫瘤細胞的CI<1,而H89聯(lián)合漢防己甲素對人的正常細胞HBL-100、L02、HEK293T的毒性較小,證明H89聯(lián)合漢防己甲素具有協(xié)同抗腫瘤活性。接下來我們展開了漢防己甲素與H89聯(lián)合抗腫瘤作用機制的研究,用PI-AnnexinV流式檢測細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)H89和漢防己甲素聯(lián)合顯著誘導腫瘤細胞凋亡,用Caspase的抑制劑z-VAD-fmk抑制細胞凋亡后能部分拯救細胞死亡;Westernblot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和GFP-LC3熒光點聚集實驗表明,H89和漢防己甲素聯(lián)合誘導腫瘤細胞自噬,進一步用mRFP-GFP-LC3檢測細胞自噬流,發(fā)現(xiàn)H89和漢防己甲素聯(lián)合促進自噬流,而用3-MA、BafilomycinA1抑制細胞自噬,能部分拯救細胞死亡,說明H89聯(lián)合漢防己甲素通過誘導細胞凋亡和自噬過程誘導細胞死亡。分子機制研究表明,H89和漢防己甲素協(xié)同激活細胞內(nèi)的ROS的累積,用NAC清除細胞內(nèi)ROS后,顯著拯救雙藥誘導的細胞死亡,同時NAC也能拯救細胞的凋亡和自噬,說明H89和漢防己甲素聯(lián)合誘導細胞死亡起始于ROS的累積。H89是PKA抑制劑,研究結(jié)果表明,H89聯(lián)合漢防己甲素抑制PKA激酶的活性,用FSK激活PKA后,能夠拯救細胞的凋亡和自噬;此外H89和漢防己甲素聯(lián)合激活細胞內(nèi)的ERK,并且這種作用主要來自漢防己甲素,PD98059抑制ERK后,能夠拯救細胞的凋亡;FSK或PD98059能部分拯救細胞的死亡,但FSK和PD98059聯(lián)合能顯著拯救細胞的死亡,說明PKA和ERK同時參與H89和漢防己甲素的聯(lián)合抗腫瘤作用,并且證明了ROS在PKA和ERK的上游。值得注意的是,我們研究發(fā)現(xiàn)c-Myc的表達水平與腫瘤細胞對H89和漢防己甲素聯(lián)合治療的敏感性有關(guān)。c-Myc高表達的細胞對雙藥聯(lián)合治療表現(xiàn)出更強的敏感性,其原因與c-Myc抑制抗凋亡蛋白Mcl-1表達水平及激活細胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。另外我們用乳腺癌細胞MDA-MB-231建立了的裸鼠異種移植瘤模型,進行動物體內(nèi)抗腫瘤作用的研究。發(fā)現(xiàn)H89和漢防己甲素聯(lián)合處理與單獨給藥組相比,能明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長,并且給藥期間小鼠的體重沒有發(fā)現(xiàn)任何減輕的跡象,小鼠的活動能力也正常,血清中AST、ALT檢測也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的肝毒性。說明H89和漢防己甲素在體內(nèi)也具有明顯的抗腫瘤作用,并且對實驗動物沒有產(chǎn)生明顯的副作用。并且我們在小鼠皮下移植瘤模型中研究了Mcl-1和c-Myc基因?qū)89和漢防己甲素聯(lián)合治療的影響,發(fā)現(xiàn)與體外細胞實驗相一致,過表達Mcl-1后抑制H89和漢防己甲素聯(lián)合抗腫瘤效果;而敲低c-Myc基因后使細胞對H89和漢防己甲素的聯(lián)合治療變得不敏感。綜上所述,本研究表明蛋白激酶抑制劑H89聯(lián)合漢防己甲素在體外和體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同增強的抗腫瘤作用。這為人類癌癥的治療提供了新的治療