多不飽和脂肪酸影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)作用機制研究

多不飽和脂肪酸影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)作用機制研究結(jié)腸癌(colorectalcancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。在我國,隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。高脂肪、高蛋白和低膳食纖維的飲食習(xí)慣是結(jié)腸癌發(fā)病的危險因素,飲食干預(yù)法是預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的有效方法,研究發(fā)現(xiàn)飲食中降低飽和脂肪的攝入提高多不飽和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)的比例,可以起到降低腫瘤發(fā)病的作用。因此,PUFAs對結(jié)腸癌的作用機制值得深入探討。本研究一方面從體外細胞實驗角度探討PUFAs對結(jié)腸癌細胞LoVo和RKO的生長抑制、線粒體損傷、脂肪酸代謝等方面的影響;另一方面從體內(nèi)動物實驗角度出發(fā),通過研究膳食長鏈不飽和脂肪酸對小鼠腸道生理環(huán)境的改善研究其對結(jié)腸癌的預(yù)防作用。體外部分以人結(jié)腸癌細胞LoVo和RKO作為研究對象,構(gòu)建了PUFAs對兩細胞的體外損傷模型,結(jié)果表明本實驗用到的六種脂肪酸亞油酸(Linoleicacid,LA)、亞麻酸(Alpha-linolenicacid,ALA)、花生四烯酸(Arachidonicacid,AA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)、γ-亞麻酸(γ-linolenicacud,GLA)濃度大于120μM均能顯著抑制LoVo和RKO細胞的生長,誘導(dǎo)兩細胞凋亡,但對正常細胞HUVEC影響較小,且半分化細胞RKO對PUFAs的敏感性較未分化細胞LoVo大。根據(jù)MTT結(jié)果,為了保證脂肪酸處理作用合理高效,我們選擇ALA(150μM)、EPA(150μM)、DHA(150μM)、LA(150μM)、GLA(300μM)、AA(150μM)、5-FU(100μM)處理LoVo細胞,以ALA(140μM)、EPA(120μM)、DHA(120μM)、LA(120μM)、GLA(200μM)、AA(120μM)、5-FU(0.4μM)處理RKO,建立PUFAs損傷結(jié)腸癌細胞體外模型。以此濃度進一步研究PUFAs對結(jié)腸癌細胞LoVo和RKO的線粒體損傷、脂肪酸代謝等方面的影響,發(fā)現(xiàn)存在如下效果:(1)從線粒體損傷的角度探討PUFAs對結(jié)腸癌細胞的抑制機制。結(jié)果表明,n-3(ALA、EPA、DHA)和n-6(LA、GLA、AA)脂肪酸作用可致LoVo和RKO細胞內(nèi)活性氧ROS水平和細胞漿內(nèi)Ca2+水平上升,ATP含量下降,導(dǎo)致Bcl-2家族中Bax/Bcl-2基因表達比上調(diào)。進而引起線粒體膜出現(xiàn)小氣孔,線粒體膜電位下降,細胞色素C和AIF等蛋白釋放到胞質(zhì)中,最終激活Caspase-9和Caspase-3活性,引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡。多不飽和脂肪酸對結(jié)腸癌細胞線粒體有一定的損傷作用,通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其走向死亡。(2)研究PUFAs在LoVo和RKO細胞內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及其代謝產(chǎn)物對兩細胞的影響。油紅O染色實驗表明外源性添加的PUFAs通過細胞膜以脂滴形式儲存于細胞質(zhì)內(nèi)。通過氣相色譜法分析PUFAs作用下結(jié)腸癌細胞內(nèi)的脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)PUFAs作用后改變了LoVo和RKO細胞內(nèi)的脂肪酸組成,提高不飽和脂肪酸比例,且在兩細胞內(nèi)n-3和n-6PUFAs之間的轉(zhuǎn)化存在緊密聯(lián)系。此外,多不飽和脂肪酸可通過抑制結(jié)腸癌細胞COX-2、mPGES、PGDS和ALOX5的表達,進而降低脂肪酸代謝產(chǎn)物促炎因子PGE2和LTB4的分泌,促進抗炎因子LXA4的分泌,使癌細胞趨于不利于其生長的抗炎狀態(tài)。體內(nèi)部分以C57BL/6小鼠為對象,通過分析富含長鏈脂肪酸的魚油、亞麻籽油、葵花籽油對小鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu),小鼠腸道主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸、膽汁酸,小鼠結(jié)腸組織脂類代謝參數(shù)的影響,分析多不飽和脂肪酸在改善腸道生理環(huán)境,預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生方面的功效。結(jié)果表明膳食長鏈脂肪酸可激活脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(PPARα、OSTα)mRNA的表達促進脂肪代謝,魚油和亞麻籽油能提高結(jié)腸組織中n-3/n-6的比值,保護結(jié)腸組織免受氧化應(yīng)激損傷。此外,膳食長鏈不飽和脂肪酸能改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),魚油和亞麻籽油處理組在Eubacterium,Novosphingobium,和Hymenobacter上的豐度高于對照組。富含n-6PUFAs的葵花籽油組的結(jié)腸微生物多樣性不如富含n-3PUFAs魚油組和亞麻籽油組。亞麻籽油、葵花籽油,特別是魚油中的多