丙泊酚對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和遷移的影響及分子機(jī)制研究

丙泊酚對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和遷移的影響及分子機(jī)制研究背景:丙泊酚(Propofol)是一種靜脈麻醉藥物,能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡并可能導(dǎo)致長(zhǎng)期的神經(jīng)認(rèn)知缺陷,尤其是在發(fā)育階段的大腦中。目前,丙泊酚在產(chǎn)科和兒科手術(shù)中已廣泛應(yīng)用,因此,我們亟需了解其作用機(jī)制,預(yù)防其有害效應(yīng)。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是一類未分化的干細(xì)胞,主要存在于胚胎和成年神經(jīng)系統(tǒng)中,可以自我更新和分化成為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細(xì)胞這三類細(xì)胞。大腦發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,其中涉及神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移等關(guān)鍵步驟。了解麻醉藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的具體作用將有助于臨床安全用藥。MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼RNA,其長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸。主要通過(guò)與其靶基因3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)的結(jié)合,進(jìn)而抑制靶基因的翻譯或使靶基因直接降解,最終調(diào)控該基因的表達(dá)。miRNAs在各種發(fā)育和生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前,在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中已發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)。據(jù)報(bào)道,miR-141-3p與干細(xì)胞的增殖、分化及衰老有密切關(guān)系。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)丙泊酚處理NSCs后能引起miR-141-3p的表達(dá)明顯上調(diào),然而,miR-141-3p在神經(jīng)干細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制尚不清楚。目的:明確丙泊酚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及遷移的影響;從miRNA這一比較新穎的角度,對(duì)丙泊酚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究,為指導(dǎo)臨床安全用藥提供理論依據(jù)。方法:(1)從孕15天的SD大鼠海馬區(qū)分離獲得神經(jīng)干細(xì)胞,利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞的干性和分化能力。用不同濃度的丙泊酚(0、5、10、20μg/mL)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間(6h或24h)的處理,通過(guò)MTT、westernblotting、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法觀察丙泊酚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及遷移的影響。(2)前期研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚處理NSCs后miR-141-3p高表達(dá)。通過(guò)慢病毒感染的方法構(gòu)建miR-141-3p表達(dá)抑制細(xì)胞即NSCs/anti-miR-141-3p,觀察該細(xì)胞經(jīng)丙泊酚處理后,神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及遷移的變化。利用靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan,miRanda和miRBase)對(duì)miR-141-3p的可能靶基因進(jìn)行分析預(yù)測(cè),從中篩選出miR-141-3p的潛在靶基因IGF2BP2;然后,利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、qRT-PCR和westernblotting確認(rèn)miR-141-3p對(duì)IGF2BP2的表達(dá)調(diào)控。(3)利用營(yíng)救實(shí)驗(yàn),在miR-141-3p與IGF2BP2共表達(dá)細(xì)胞中,觀察丙泊酚處理后,神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及遷移的變化;在miR-141-3p和IGF2BP2同時(shí)抑制細(xì)胞中,觀察丙泊酚處理后,神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及遷移的變化。結(jié)果:(1)成功分離出E15大鼠的NSCs,經(jīng)免疫熒光證實(shí)該干細(xì)胞為Nestin陽(yáng)性,并且在特定條件下可以分化為神經(jīng)元(β-tubulinIII陽(yáng)性)及星型膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性);20μg/mL丙泊酚處理NSCs6h能顯著抑制NSCs的增殖、分化和遷移作用;(2)20μg/mL丙泊酚處理NSCs6h后,miR-141-3p表達(dá)水平顯著提高;anti-miR-141-3p能夠破壞丙泊酚對(duì)NSCs增殖、分化和遷移的抑制作用;IGF2BP2是miR-141-3p的一個(gè)靶基因,并且20μg/mL丙泊酚處理NSCs6h后,IGF2BP2表達(dá)水平明顯降低;(3)IGF2BP2過(guò)表達(dá)營(yíng)救了丙泊酚對(duì)NSCs增殖、分化和遷移的抑制作用,與anti-miR-141-3p有類似的結(jié)果;而miR-141-3p與IGF2BP2共表達(dá)破壞了IGF2BP2對(duì)NSCs的效果。miR-141-3p和IGF2BP2同時(shí)抑制后,IGF2BP2siRNA反轉(zhuǎn)了anti-miR-141-3p對(duì)NSCs增殖、分化和遷移