丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞低氧再復(fù)氧損傷的保護(hù)和機(jī)制研究

丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞低氧再復(fù)氧損傷的保護(hù)和機(jī)制研究【研究背景】隨著神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、現(xiàn)代診斷學(xué)及神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步,神經(jīng)外科手術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用到了癲癇、腦腫瘤、腦卒中等疾病的治療。然而,近年的研究也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)外科手術(shù)會產(chǎn)生諸如腦血管痙攣、心功能障礙、電解質(zhì)紊亂以及術(shù)后腦部缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusioninjury,IRI）等并發(fā)癥。因此,如何避免術(shù)后損傷和并發(fā)癥,提高患者術(shù)后生存質(zhì)量日益受到關(guān)注。同時也對神經(jīng)外科的麻醉工作提出了更加嚴(yán)峻的要求:首先,根據(jù)手術(shù)類型制訂更加合理的麻醉方案,最大程度地配合手術(shù)操作;其次,合理有效地將腦保護(hù)基礎(chǔ)研究應(yīng)用于臨床,改善術(shù)后患者生存質(zhì)量。大量研究表明,麻醉藥物具有細(xì)胞保護(hù)作用。因此更好地認(rèn)識其作用機(jī)制,可為臨床提供更多的改善預(yù)后的策略。丙泊酚是目前臨床上普遍用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持、ICU危重患者患者鎮(zhèn)靜的一種快速、短效的靜脈麻醉藥。它具有麻醉誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速且功能恢復(fù)完善、術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。近年的研究還發(fā)現(xiàn)丙泊酚在產(chǎn)生廣泛中樞抑制作用的同時,還具有降低腦耗氧量、降低顱內(nèi)壓（intracranialpressure,ICP）和抗驚厥、抗炎癥、抗氧化以及支氣管舒張等特性,能夠減輕神經(jīng)外科手術(shù)術(shù)后腦組織和血管損傷。然而,丙泊酚對于腦血管缺氧損傷的具體保護(hù)機(jī)制尚未十分明確。平滑肌細(xì)胞廣泛分布于人體消化道、呼吸道、血管和泌尿生殖等系統(tǒng)。在功能上通過縮短和產(chǎn)生張力使器官發(fā)生運(yùn)動和變形,也可產(chǎn)生持續(xù)或緊張性收縮,使器官對抗所加負(fù)荷而保持一定的形態(tài),前者如胃和腸道,后者如動脈血管、括約肌等。血管平滑肌細(xì)胞是血管中膜的主要成分,它不僅是維持血管壁結(jié)構(gòu)完整性的物質(zhì)基礎(chǔ),也在血管收縮、調(diào)節(jié)血管張力和血壓以及血流分布等生理功能方面發(fā)揮重要作用,是血管性疾病病變的主要細(xì)胞成分之一,在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。血液需要依賴血管為載體輸送到組織。在缺血性疾病的再灌注過程中,如何維持正常的血管功能也是面臨的關(guān)鍵課題之一。目前大量學(xué)者著眼于研究腦缺血再灌注損傷對神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響,并探討了其可能機(jī)制,對人腦血管平滑肌細(xì)胞（humanbrainvascularsmoothmusclecells,HBVSMC）的研究鮮有報道。目前HBVSMC細(xì)胞的離體培養(yǎng)是血管研究中的重要模型,為血管疾病的藥理學(xué)和治療研究提供大量信息?！狙芯磕康摹勘狙芯恳噪x體培養(yǎng)HBVSMC細(xì)胞為研究對象,建立離體HBVSMC細(xì)胞低氧再復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型模擬缺血再灌注,觀察丙泊酚對HBVSMC細(xì)胞H/R后的細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響,研究H/R對HBVSMC細(xì)胞的損傷及丙泊酚的保護(hù)作用。同時進(jìn)一步檢測相關(guān)蛋白表達(dá),初步探討H/R對HBVSMC細(xì)胞的損傷及丙泊酚的保護(hù)作用的可能機(jī)制。本研究有助于闡明H/R對HBVSMC細(xì)胞的損傷作用,證實(shí)丙泊酚對HBVSMC細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用,為進(jìn)一步防治缺血再灌注損傷提供新的理論依據(jù)。【研究方法】本研究分為以下三部分:第一部分:建立人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞培養(yǎng):HBVSMC細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海,中國）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%GIBCO胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,并添加1%青霉素和鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃的濕潤環(huán)境中,氣體環(huán)境為5%的二氧化碳和95%的空氣構(gòu)成的混合氣體。通過三氣培養(yǎng)箱和低氧/厭氧工作站控制環(huán)境氧氣濃度,將細(xì)胞于低氧條件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下分別暴露2h、4h、6h、8h、10h。低氧后,細(xì)胞再恢復(fù)到常氧條件（5%CO₂和95%空氣）下培養(yǎng)16h。利用CCK-8檢測細(xì)胞的生存活性,采用ELISA法測定細(xì)胞上清液SOD、LDH和MDA水平。第二部分:觀察不同濃度的丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷的作用H/R后HBVSMC細(xì)胞活力抑制率為40%左右的低氧再復(fù)氧條件為HBVSMC細(xì)胞最佳H/R條件。根據(jù)第一部分研究結(jié)果顯示,最后確定低氧條件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h為實(shí)驗(yàn)所需低氧條件。將丙泊酚在低氧前加入丙泊酚組細(xì)胞培養(yǎng)液中,使終濃度達(dá)到25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三種不同濃度。將細(xì)胞于低氧條件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h。低氧后將細(xì)胞恢復(fù)到常氧條件（再氧化）再培養(yǎng)16h。利用CCK-8檢測各組細(xì)胞的生存活性,采用ELISA法測定細(xì)胞上清液SOD、LDH和MDA水平;通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;利用Westernblot方法測定細(xì)胞的Bax、Bcl-2、Caspase3、Sur2b、Kir6.1、JNK、p-JNK、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)水平。第三部分:探討丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷保護(hù)作用的機(jī)制第二部分研究發(fā)現(xiàn),50μmol/L濃度的丙泊酚的細(xì)胞保護(hù)作用最佳,所以我們采用50μmol/L丙泊酚+SP600125/Everolinmus在低氧前添加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。細(xì)胞在低氧條件（0.5%O₂、5%CO₂和94.5%N₂）下暴露8h。兩種藥物干預(yù)之后,利用CCK-8檢測各組細(xì)胞的生存活性,采用ELISA法測定細(xì)胞上清液SOD、LDH和MDA水平;通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;利用Westernblot方法測定細(xì)胞的Bax、Bcl-2、Caspase3、Sur2b、Kir6.1、JNK、p-JNK、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】第一部分:建立人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷模型與對照組相比,各低氧組細(xì)胞在H/R后細(xì)胞活性均顯著降低,且隨著低氧時間延長細(xì)胞活性遞減。各低氧組細(xì)胞LDH、MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低。隨著低氧時間的延長,各低氧組細(xì)胞LDH、MDA含量遞增,相反SOD活性遞減。本研究結(jié)果顯示,最后確定低氧條件下暴露8h為實(shí)驗(yàn)所需低氧條件。第二部分:觀察不同濃度的丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷的作用與模型組比較,丙泊酚處理明顯抑制細(xì)胞存活率的降低。丙泊酚對H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的抑制作用具有一定的劑量依賴性。100μmol/L濃度的丙泊酚處理后細(xì)胞活性略有下降。因此,50μmol/L的丙泊酚細(xì)胞保護(hù)作用最佳。和模型組對比,丙泊酚的預(yù)處理顯著的抑制H/R引起的LDH釋放,降低MDA含量,同時顯著提升SOD活性。丙泊酚顯著降低H/R后細(xì)胞的凋亡率。Westernblot結(jié)果顯示,丙泊酚顯著抑制H/R后Bax,Caspase3,Kir6.1和JNK蛋白表達(dá)的上調(diào),同時顯著抑制Bcl-2和p-mTOR蛋白表達(dá)的下調(diào)。第三部分:探討丙泊酚對人腦血管平滑肌細(xì)胞H/R損傷保護(hù)作用的機(jī)制在細(xì)胞低氧前分別加入丙泊酚聯(lián)合JNK的抑制劑SP600125或mTOR抑制劑Everolimus進(jìn)行研究。與丙泊酚預(yù)處理組對比,丙泊酚+SP600125組的細(xì)胞存活率高于丙泊酚組,進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率,顯著提高細(xì)胞活性;Bax、Caspase3、Kir6.1和p-JNK蛋白表達(dá)相對于丙泊酚組進(jìn)一步顯著降低,Bcl-2和p-mTOR蛋白的表達(dá)顯著增加。相反地,丙泊酚+Everolimus組抑制丙泊酚對于細(xì)胞H/R損傷后的保護(hù)作用。丙泊酚+Everolimus組細(xì)胞存活率低于丙泊酚組,使細(xì)胞凋亡率升高,顯著降低細(xì)胞活性;Bax、Caspase3、K