赤眼蜂種間Wolbachia轉(zhuǎn)染與生防潛力研究

赤眼蜂種間Wolbachia轉(zhuǎn)染與生防潛力研究赤眼蜂(Trichogrammaspp.)是全世界害蟲(chóng)生物防治中研究最多、應(yīng)用最廣的一類(lèi)卵寄生性天敵,廣泛用于防治玉米、水稻、果樹(shù)和森林等植物害蟲(chóng),取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。節(jié)肢動(dòng)物胞內(nèi)共生菌沃爾巴克氏體(Wolbachia)由于調(diào)控宿主進(jìn)化和影響宿主生殖等行為以及作為外源基因的載體等領(lǐng)域的應(yīng)用前景,近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Wolbachia廣泛分布于赤眼蜂屬寄生蜂中,能誘導(dǎo)赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖,且可在種內(nèi)垂直傳播和種間水平傳播,已報(bào)道有21種赤眼蜂感染W(wǎng)olbachia。由于Wolbachia具有誘導(dǎo)寄生蜂產(chǎn)雌孤雌生殖與增強(qiáng)雌性生殖力的特性,因而Wolbachia可以作為特定的遺傳工具對(duì)其宿主進(jìn)行遺傳調(diào)控,利用其來(lái)改變天敵昆蟲(chóng)的生殖特性,通過(guò)將不具產(chǎn)雌孤雌生殖特性的優(yōu)良天敵蜂種人為感染W(wǎng)olbachia而誘導(dǎo)寄生蜂行產(chǎn)雌孤雌生殖,從而增加雌蜂比例,降低繁蜂成本,提高生物防治效能具有重要意義。本論文按Wolbachia供體蜂的篩選;摸索Wolbachia水平人工轉(zhuǎn)染方法并探討轉(zhuǎn)染機(jī)制;轉(zhuǎn)染成功致使生殖方式改變的赤眼蜂生物學(xué)特性研究,包括外界環(huán)境因子的應(yīng)答能力,嗅覺(jué)反應(yīng)和種群參數(shù);以及Wolbachia在赤眼蜂體內(nèi)的適合度和田間大面積釋放防治玉米螟的效果等內(nèi)容相繼展開(kāi)。本論文的主要內(nèi)容及取得的初步成果如下:1.利用改良的“Y”型嗅覺(jué)儀來(lái)測(cè)定感染W(wǎng)olbachia的卷蛾赤眼蜂(Trichogrammacacoeciae)、食胚赤眼蜂(Trichogrammaembryophagum)和短管赤眼蜂(Trichogrammapretiosum)3種產(chǎn)雌孤雌生殖赤眼蜂對(duì)米蛾卵表和雌蛾腹部鱗片正己烷萃取物的趨性反應(yīng),評(píng)價(jià)其搜索寄主能力、寄生和羽化能力;觀察了經(jīng)抗生素處理后Wolbachia在3種赤眼蜂體內(nèi)的穩(wěn)定性,探討Wolbachia菌被去除后宿主赤眼蜂的生殖能力變化情況。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗生素處理后食胚赤眼蜂后代羽化雄性最少,其體內(nèi)Wolbachia與宿主食胚赤眼蜂共生比較穩(wěn)定,且該蜂嗅覺(jué)反應(yīng)靈敏,寄生能力強(qiáng),故認(rèn)為食胚赤眼蜂體內(nèi)Wolbachia是水平人工轉(zhuǎn)染較理想株系,適合作Wolbachia水平轉(zhuǎn)染的供體。2.以產(chǎn)雌孤雌生殖食胚赤眼蜂為供體,兩性生殖的松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogrammadendrolimi、玉米螟赤眼蜂Trichogrammaostriniae、螟黃赤眼蜂Trichogrammachilonis和甘藍(lán)夜蛾赤眼蜂Trichogrammabrassicae為受體,通過(guò)共享食物源、顯微注射、取食菌懸液三種方法研究Wolbachia在赤眼蜂種間水平人工傳播。結(jié)果表明,通過(guò)共享食物源方法由食胚赤眼蜂向松毛蟲(chóng)赤眼蜂的種間水平轉(zhuǎn)染獲得成功,受體松毛蟲(chóng)赤眼蜂生殖方式由兩性生殖方式轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)雌孤雌生殖,生殖方式穩(wěn)定;分子檢測(cè)產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂體內(nèi)Wolbachia菌wsp序列與供體食胚赤眼蜂核苷酸同一性達(dá)99%,同屬于Wolbachia菌群B大組Dei亞組,而與同組Pip亞組寄主米蛾(Corcyracephalonica)wsp同一性較遠(yuǎn)為81%。其它供試赤眼蜂種不能通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)水平轉(zhuǎn)染。利用顯微注射法獲得了產(chǎn)兩性孤雌生殖甘藍(lán)夜蛾赤眼蜂,松毛蟲(chóng)赤眼蜂部分表現(xiàn)了產(chǎn)雌孤雌生殖。赤眼蜂成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)取食菌懸液不能實(shí)現(xiàn)種間Wolbachia的水平傳播。研究結(jié)果除可以篩選獲得攜帶Wolbachia且寄生能力強(qiáng)的優(yōu)良赤眼蜂蜂種或品系,形成現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)力外,有望提供新的調(diào)控生物生殖方式的手段。3.以成功轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia產(chǎn)雌孤雌生殖松毛蟲(chóng)赤眼蜂為材料,分析了25℃和32℃兩種溫度下交配處理、不同交配組合及抗生素處理后產(chǎn)雌孤雌生殖松毛蟲(chóng)赤眼蜂的寄生數(shù)和羽化數(shù)等生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明,25℃溫度條件下,產(chǎn)雌孤雌赤眼蜂連續(xù)多代培養(yǎng)生殖方式穩(wěn)定,與雄性交配盡管降低寄生能力但生殖方式?jīng)]有改變:32℃高溫條件下,與雄蜂交配和未交配的產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂連續(xù)處理4代(大約30天)體內(nèi)Wolbachia都完全失活,恢復(fù)產(chǎn)雄孤雌生殖方式。實(shí)驗(yàn)表明,與雄蜂交配不會(huì)改變感染W(wǎng)olbachia松毛蟲(chóng)赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌的生殖方式,抗生素處理和持續(xù)至少20天的32℃高溫才是改變其生殖方式的決定因素?？股乜梢匀コ擅x(chóng)赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia并恢復(fù)兩性的生殖方式,供試抗生素在中低濃度(25mg/mL)誘導(dǎo)出的雄蜂最多,而且經(jīng)抗生素去除獲得的雄性和雌性具有正常的生殖功能。本研究明確外界生態(tài)因子對(duì)感染W(wǎng)olbachia松毛蟲(chóng)赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖方式遺傳穩(wěn)定性的影響,為感染W(wǎng)olbachia松毛蟲(chóng)赤眼蜂的陽(yáng)間釋放提供理論依據(jù)。4.采用與未感染的兩性品系松毛蟲(chóng)赤眼蜂相對(duì)比的方法,研究了產(chǎn)雌孤雌生殖松毛蟲(chóng)赤眼蜂對(duì)不同寄主揮發(fā)物的嗅覺(jué)反應(yīng)能力、寄生及羽化能力。結(jié)果表明,產(chǎn)雌孤雌品系松毛蟲(chóng)赤眼蜂對(duì)供試的幾種鱗翅目害蟲(chóng)(米蛾Corcyracephalonica、玉米螟Ostriniafurnacalis、柞蠶Antheraeapernyi)卵表和雌蛾腹部鱗片揮發(fā)物均有不同程度的趨性,對(duì)玉米螟卵表?yè)]發(fā)物的趨性較兩性品系強(qiáng),在恒定溫濕度(25℃,RH70%)條件下對(duì)幾種寄主卵的寄生能力均強(qiáng)于兩性品系松毛蟲(chóng)赤眼蜂,但兩者間差異不明顯。在不同蜂卵比接蜂的試驗(yàn)中,30粒(1塊)玉米螟卵,除接入2頭蜂時(shí),正常兩性品系的松毛蟲(chóng)赤眼蜂寄生能力高于產(chǎn)雌孤雌品系外,接入其它數(shù)量如1、3、4頭蜂時(shí)產(chǎn)雌孤雌品系寄生能力均高于兩性品系松毛蟲(chóng)赤眼蜂?？傮w來(lái)看,產(chǎn)雌孤雌品系松毛蟲(chóng)赤眼蜂在不同蜂卵比情況下,對(duì)玉米螟卵的寄生能力要強(qiáng)于正常兩性品系。本項(xiàng)研究為感染W(wǎng)olbachia的松毛蟲(chóng)赤眼蜂田間防治玉米螟及其它重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)提供了助力。5.為探討感染W(wǎng)olbachia的產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂的最佳繁殖條件。本試驗(yàn)對(duì)感染W(wǎng)olbachia松毛蟲(chóng)赤眼蜂不同溫度下的生殖參數(shù)進(jìn)行了研究。以柞蠶卵為寄主,在16℃、20℃、24℃、28℃和32℃5個(gè)恒溫條件下松毛蟲(chóng)赤眼蜂發(fā)育、存活和繁殖的情況,構(gòu)建了相應(yīng)溫度下的實(shí)驗(yàn)種群生命表。結(jié)果表明,溫度24℃～28℃為繁殖感染W(wǎng)olbachia產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂的理想溫度條件,可以作為松毛蟲(chóng)赤眼蜂的工廠化生產(chǎn)作業(yè)指標(biāo)。6.對(duì)人工水平轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂的田間防治效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)選取遼寧沈陽(yáng)和岫巖兩地區(qū),約600畝玉米田連續(xù)兩年釋放產(chǎn)雌孤雌松毛蟲(chóng)赤眼蜂,評(píng)價(jià)其對(duì)玉米螟的防治效果。通過(guò)兩年調(diào)查發(fā)現(xiàn):產(chǎn)雌孤雌和正常兩性