農(nóng)推-林業(yè)生物技術(shù)-基因工程

農(nóng)推-林業(yè)生物技術(shù)-基因工程林木基因工程本章要點(diǎn)2.1基因工程的差不多知識(shí)2.2植物基因的分離克隆2.3植物遺傳轉(zhuǎn)化2.4基因工程與林木遺傳改良2.1基因工程的差不多知識(shí)基因工程遺傳工程，重組DNA技術(shù)(DNArecombination)是指采納分子生物學(xué)手段，將不同來(lái)源的基因，按照人類(lèi)的愿望，在體外進(jìn)行重組，然后將重組的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使原有生物產(chǎn)生新的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品的技術(shù)科學(xué)。能夠跨過(guò)天然物種屏障，把來(lái)自任何一種生物的基因?qū)氲叫碌纳镏?，?shí)現(xiàn)不同生物的基因重組或基因轉(zhuǎn)移，達(dá)到對(duì)某種生物個(gè)不性狀遺傳改良的目的。是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心和支柱?；蚪M某種生物體或一個(gè)細(xì)胞所攜帶的全部DNA序列的總和。狹義的基因組（genome）是專(zhuān)指核基因組。廣義的基因組還包括葉綠體基因組和線粒體基因組。核基因組是指堅(jiān)持生物體完整生命功能所必須的1組染色體或配子體（性細(xì)胞）所包含的全部DNA序列（nDNA）。一個(gè)生物物種單倍體基因組的DNA含量稱為該物種的C值，每一個(gè)生物物種的C值是恒定的，一樣用pg或堿基對(duì)表示。1pg=10-12g，相當(dāng)于31cm長(zhǎng)的DNA排列，約109bp。葉綠體基因組葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，葉綠體中含有獨(dú)立于核基因組以外的葉綠體基因組，稱為cpDNA。一個(gè)植物葉片細(xì)胞通常含有數(shù)百個(gè)葉綠體，一個(gè)葉綠體中含20-80個(gè)cpDNA拷貝。銀杏的葉綠體基因組為158kb。線粒體基因組線粒體是動(dòng)植物細(xì)胞將有機(jī)物質(zhì)氧化降解成水和二氧化碳、并開(kāi)釋出能量的細(xì)胞器。也含有獨(dú)立于核基因組以外的基因組，稱為線粒體基因組，其DNA稱為線粒體基因組DNA（mtDNA）。植物的線粒體基因組比動(dòng)物要大得多。植物線粒體基因組含有數(shù)目不等的內(nèi)含子序列?；蛑妇幋a功能蛋白質(zhì)或RNA分子所必須的DNA序列或RNA序列，是遺傳的功能單位，可產(chǎn)生或阻礙某種表型。一樣又可分為結(jié)構(gòu)基因(structuregene)：編碼蛋白質(zhì)（或RNA）調(diào)控基因(controlgene)：調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。通常指結(jié)構(gòu)基因。真核基因的結(jié)構(gòu)2.2目的基因的克隆2.2.1基因克隆的工具酶2.2.2基因克隆的載體2.2.3基因克隆的方法2.2.1基因克隆的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶restrictionendonucleaseDNA連接酶DNAligaseDNA聚合酶DNApolymerase反轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶S1核酸酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶2.2.1.1限制性內(nèi)切核酸酶限制作用：一定類(lèi)型的細(xì)菌能夠通過(guò)限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA（如噬菌體DNA），使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞的入侵受到限制。修飾作用：生物細(xì)胞自身的DNA分子通過(guò)修飾酶的作用，在堿基中特定的位置發(fā)生了甲基化，而得到修飾，可免遭自身限制性酶的破壞。2.2.1.1限制性內(nèi)切核酸酶要緊有I型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅱ型運(yùn)用最廣泛，I型和Ⅲ型應(yīng)用極少。I型目前發(fā)覺(jué)的只有EcoB和EcoK兩種，Ⅲ型目前已知的要緊是EcoPI和EcoP15。(1)Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的特點(diǎn)①能夠識(shí)不特異性的DNA識(shí)不位點(diǎn)，這種識(shí)不位點(diǎn)通常具有雙鏈回文對(duì)稱的結(jié)構(gòu)；②切割后形成的雙鏈DNA分子能夠彼此互補(bǔ)，并能夠重新連接；③切割和修飾功能由兩種不同的酶催化完成；④切割不需要ATP和SAM（硫腺苷甲硫苷酸）作為活性催化因子。（2）命名和分類(lèi)①利用屬名的第1個(gè)字母和種名的前2個(gè)字母代表內(nèi)切酶的來(lái)源。例如，來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)的內(nèi)切酶用Eco來(lái)命名，來(lái)自流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）的用Hin表示。②第4個(gè)字母表示酶來(lái)源的菌株和菌型。例如，EcoRI中的R表示該酶來(lái)自大腸桿菌的R菌株。③在同一菌株分離獲得的不同內(nèi)切酶按照分離時(shí)刻的先后，以羅馬數(shù)字加以標(biāo)注，如HindI、HindⅡ、HindⅢ。（3）阻礙因素①DNA的濃度和質(zhì)量----最關(guān)鍵的因素。②酶切消化的緩沖液。③酶切反應(yīng)的溫度。④其它因素。（4）應(yīng)用①構(gòu)建重組的DNA分子。②探針預(yù)備。③DNA物理圖譜構(gòu)建。④DNA甲基化分析。2.2.1.2DNA聚合酶作用：將脫氧核糖核酸連續(xù)地連接到雙鏈DNA分子的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，形成長(zhǎng)鏈的核酸分子。(1)大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow酶大腸桿菌DNA聚合酶I的作用：①DNA缺口平移，制備DNA探針。②用于DNA序列分析。Klenow酶的要緊用途：①DNA放射性標(biāo)記。②合成cDNA的第2鏈。③補(bǔ)平內(nèi)切酶切割雙鏈DNA分子形成的粘性末端。④DNA測(cè)序。（2）T4DNA聚合酶具有5＇→3＇DNA聚合活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。其3＇→5＇外切核酸酶活性比Klenow酶強(qiáng)200倍。要緊作用：限制性內(nèi)切酶的末端補(bǔ)平；標(biāo)記探針；切平雙鏈的DNA末端。（3）T7DNA聚合酶連續(xù)合成能力強(qiáng)，催化合成的DNA片段比其它聚合酶催化合成的長(zhǎng)得多。具有專(zhuān)門(mén)強(qiáng)的3‘→5’外切核酸酶活性，為Klenow酶的1000倍。要緊用于長(zhǎng)片段DNA的合成，也用于DNA分子的快速末端標(biāo)記。測(cè)序酶：通過(guò)修飾，失去了3＇→5＇外切核酸酶活性的T7DNA聚合酶。（4）TaqDNA聚合酶從極度嗜熱的嗜熱水生菌Thermusaquaticus中獲得，能在94℃高溫環(huán)境中存活3小時(shí)以上。具有DNA聚合酶活性和5‘→3’外切核酸酶活性。最佳聚合溫度在72～80℃。常用于PCR(polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增。（4）TaqDNA聚合酶阻礙TaqDNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的要緊因素：①模板DNA濃度。25μl的反應(yīng)體系中10～50ng雙鏈DNA。②引物結(jié)構(gòu)及濃度。引物長(zhǎng)度一樣10～30bp，一對(duì)引物擴(kuò)增的片段在200～3000bp。引物濃度10～50mmol/L。③Mg2＋濃度。1.5～2.5mmol/L。④退火溫度。因引物而異，一樣引物50～60℃最佳。⑤緩沖液；⑥TaqDNA聚合酶的濃度和用量。（5）RNA反轉(zhuǎn)錄酶以RNA單鏈為模板，通過(guò)DNA聚合作用形成復(fù)合雙鏈cDNA。目前要緊有2種，AMV和M-MLV，均無(wú)3＇→5＇外切核酸酶活性。（6）DNA連接酶、RNA連接酶DNA連接酶連接雙鏈DNA。已知的有2種（大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶）。前者需要NAD＋參與催化，不需要ATP作為能量；后者同時(shí)需要NAD＋與ATP。二者可催化粘性末端及平末端的連接反應(yīng)。不能催化單鏈DNA的連接。單鏈DNA或RNA的連接可使用T4RNA連接酶。（7）其它酶類(lèi)末端轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸化酶、S1核酸酶、BAL31核酸酶、核糖核酸酶A、脫氧核糖核酸酶I、外切核酸酶Ⅲ，等等。末端轉(zhuǎn)移酶:將脫氧核糖核酸分子按照5＇→3＇方向逐個(gè)加入到線性DNA分子末端的一種酶類(lèi)。用途：①同聚物加尾；②3＇末端標(biāo)記。堿性磷酸化酶:將5＇末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換為OH，即脫磷酸作用。2.2.2基因克隆的載體載體(vector)：在基因工程中，用于攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。載體本身是DNA。載體的差不多條件：①含有1個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)，供外源DNA片段的插入到載體上。②能進(jìn)行自我復(fù)制，或外源DNA片段能夠整合到染色體上，隨染色體而進(jìn)行復(fù)制。③具有選擇標(biāo)記。④安全，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。⑤分子量小，多拷貝，易于操作。2.2.2基因克隆的載體載體種類(lèi)：質(zhì)粒載體噬菌體載體（包括以噬菌體和質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的Cosmid載體）人工染色體載體（YAC、BAC、PAC、TAC）(1)質(zhì)粒載體質(zhì)粒是存在于宿主細(xì)胞染色體外的一種裸露的雙鏈DNA分子。多呈閉合環(huán)狀，也有例外。商業(yè)化的質(zhì)粒載體一樣3～5kb長(zhǎng)。目前已有上百種，如常用的pUC18/19。(2)λ噬菌體載體λ噬菌體是以大腸桿菌為宿主的病毒，具有極高的感染能力，能夠?qū)Ｒ恍缘闹亟M整合到大腸桿菌的染色體上，以原噬菌體的形式長(zhǎng)期埋伏在大腸桿菌中。λ噬菌體載體實(shí)際可插入的片段長(zhǎng)度可達(dá)20kb。要緊用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建。(3)Cosmid載體結(jié)合了λ噬菌體載體和大腸桿菌質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)，本身片段小，但裝載能力大，可插入15-45kb，可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。(4)噬菌粒(Phagemid)載體也是在λ噬菌體載體和大腸桿菌質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上進(jìn)展起來(lái)的。與Cosmid載體有許多相似之處，如分子量更小。(5)人工染色體載體酵母人工染色體（YAC，yeastartificialchromosome），最大優(yōu)點(diǎn)是能夠插入較大的外源片段，可達(dá)2000kb。細(xì)菌人工染色體（BAC），穿梭細(xì)菌人工染色體（BIBAC）。P1人工染色體（PAC），可轉(zhuǎn)基因人工染色體（TAC）。不同類(lèi)型載體比較2.2.3基因克隆的方法2.2.3.1基因文庫(kù)構(gòu)建與基因克隆2.2.3.2已知基因產(chǎn)物的基因克隆2.2.3.3圖位克隆2.2.3.4差示克隆2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克隆（1）基因文庫(kù)的概念基因文庫(kù)（genelibrary）：某生物類(lèi)型全部基因的集合。這種集合是以重組體形式顯現(xiàn)。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落(或噬菌斑，或成活細(xì)胞)即為一個(gè)DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫(kù)。2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克隆構(gòu)建基因文庫(kù)的意義：①使生物的遺傳信息以穩(wěn)固的重組體形式貯存起來(lái)。②是分離克隆目的基因的要緊途徑。③關(guān)于復(fù)雜的染色體DNA分子來(lái)講，單個(gè)基因所占比例十分微小。要想從龐大的基因組中將其分離出來(lái)，一樣需要先進(jìn)行擴(kuò)增，因此需要構(gòu)建基因文庫(kù)。④在專(zhuān)門(mén)多情形下目的基因的分離都離不開(kāi)基因文庫(kù)。⑤基因文庫(kù)也是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)。2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克隆（2）基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)：將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。按照DNA來(lái)源，又有核基因組文庫(kù)、葉綠體基因組文庫(kù)及線粒體基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)：某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。區(qū)不：cDNA文庫(kù)有時(shí)效性。2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克隆（3）構(gòu)建基因文庫(kù)的差不多程序-①植物DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。-②載體的選擇及制備。-③DNA片段或cDNA與載體連接。-④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。-⑤轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克?。?）基因組文庫(kù)必須符合以下要求：a）能夠覆蓋整個(gè)基因組。b）插入的片段比較大。c）文庫(kù)比較穩(wěn)固，且易于儲(chǔ)存和操作。2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克?。?）植物cDNA文庫(kù)構(gòu)建克隆載體：要緊是質(zhì)粒及λ噬菌體。步驟：①細(xì)胞總RNA提取，并分離純化出mRNA；②合成cDNA第一鏈；③將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA；④雙鏈cDNA重組到載體上。前3步為cDNA合成，第④步為cDNA克隆。用插入型λ噬菌體載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)的流程2.2.3.1基因文庫(kù)的構(gòu)建與基因克?。?）基因文庫(kù)選擇方法①核酸雜交法；②免疫學(xué)檢測(cè)法；③DNA同胞選擇法；④PCR選擇法；⑤其他方法。2.2.3.2已知基因產(chǎn)物的基因克隆以氨基酸序列為基礎(chǔ)的基因克隆方法是最為經(jīng)典的方法。通過(guò)對(duì)表達(dá)的或者差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的序列進(jìn)行測(cè)定分析，獲得該蛋白質(zhì)的一段氨基酸的序列。按照編碼不同氨基酸的密碼子設(shè)計(jì)出一條簡(jiǎn)并引物，利用這條引物進(jìn)行RT-PCR或RACE-PCR擴(kuò)增，克隆基因的全長(zhǎng)。2.2.3.2已知基因產(chǎn)物的基因克隆此外，在進(jìn)化過(guò)程中，蛋白質(zhì)編碼的氨基酸存在著保守區(qū)段，這些保守區(qū)段在不同生物種、屬間，甚至不同門(mén)類(lèi)之間存在著高度的同源性。如果在某一種生物體中該基因差不多被克隆，也能夠利用這些保守區(qū)段的核苷酸為探針來(lái)選擇cDNA文庫(kù)?；蛘呃媚莻€(gè)引物與基因的5＇和3＇端的專(zhuān)門(mén)引物配對(duì)，進(jìn)行RACE-PCR擴(kuò)增克隆基因的全長(zhǎng)。2.2.3.3圖位克隆圖位克?。╩ap-basedcloning）是以分子標(biāo)記連鎖圖譜為基礎(chǔ)的基因克隆方法，又稱為定位克?。╬ositionalcloning）。2.2.3.3圖位克隆差不多原理：功能基因在基因組中都有相對(duì)較穩(wěn)固的基因座。在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記選擇DNA文庫(kù)（包括YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文庫(kù)），從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜，通過(guò)染色體步移（chromosomewalking）逐步靠近目的基因，或通過(guò)染色體登陸（Chromosomelanding）方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證目的基因的功能。2.2.3.3圖位克隆差不多步驟：①通過(guò)遺傳分析，將目的基因定位在染色體的一定區(qū)間內(nèi)，或在目的基因兩側(cè)獲得若干連鎖的分子標(biāo)記。②構(gòu)建含有較大基因組片段插入的文庫(kù)，如BAC文庫(kù)、YAC文庫(kù)及Cosmid文庫(kù)等。③通過(guò)染色體步移法或者染色體跳步法，分離含有目的基因的插入候選克隆。④對(duì)基因片段進(jìn)行功能互補(bǔ)分析、序列測(cè)定和基因結(jié)構(gòu)鑒定。2.2.3.4差示克隆植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗擊外界各種因素的侵害等過(guò)程，是基因的周密調(diào)控過(guò)程。在植物整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，有大量的基因參與表達(dá)，這些基因的表達(dá)時(shí)刻、空間及豐度等方面各不相同。由于這些不同基因在時(shí)空上的表達(dá)變化，使得利用基因表達(dá)差異來(lái)分離各種不同的植物基因成為可能。按照基因的表達(dá)變化克隆基因，是基因克隆方法創(chuàng)新最為活躍的一個(gè)領(lǐng)域，利用基因表達(dá)差異進(jìn)展起來(lái)的基因克隆方法達(dá)到了數(shù)十種之多。2.2.3.4差示克?。?）文庫(kù)扣除雜交法（2）mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（differentialdisplayreversetranscriptPCR，DDRT-PCR）（3）抑制消減雜交法(suppressionsubtractivehybridization，SSH)（4）代表性差異顯示法（representationaldifferenceanalysis，DNA）（1）文庫(kù)扣除雜交法差異表達(dá)基因克隆的最經(jīng)典方法。具有同時(shí)對(duì)所有的克隆子進(jìn)行選擇的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：a）雜交的工作量比較大；b）關(guān)于那種表達(dá)差異在2個(gè)不同的組織間不是完全有/無(wú)的基因，或者差異表達(dá)的基因的表達(dá)的豐度比較低時(shí)，采納這種方法分離克隆基因較困難；c）分離克隆基因的假陽(yáng)性比例較高。（1）文庫(kù)扣除雜交法當(dāng)某個(gè)或者某些基因在這兩種不同的組織之間存在著差異表達(dá)時(shí)，利用其中一種組織中所有表達(dá)的cDNA為探針，選擇出在兩種不同組織中差異表達(dá)的基因。利用其中一個(gè)組織中所有表達(dá)的cDNA為探針，分不與兩個(gè)不同的cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交，雜交以后的斑點(diǎn)在兩個(gè)不同的文庫(kù)中存在著差異。其中，一個(gè)文庫(kù)中顯現(xiàn)探針的雜交斑點(diǎn)，另一個(gè)cDNA文庫(kù)中不存在雜交斑點(diǎn)，那么那個(gè)斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的克隆確實(shí)是陽(yáng)性的克隆子。在該克隆子中所插入的外源片段確實(shí)是差異表達(dá)的基因。（2）mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCRLiangPeng等人于1992年創(chuàng)立。要緊用于比較兩個(gè)或者多個(gè)不同組織之間基因表達(dá)差異的一種快速而又簡(jiǎn)單的方法。2.3植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)又稱植物基因工程，是指通過(guò)一定的方法將從動(dòng)物、植物或微生物中分離到的目的基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之表達(dá)并穩(wěn)固遺傳，從而給予植物新性狀的技術(shù)。所產(chǎn)生的植物新類(lèi)型稱為轉(zhuǎn)基因植物。植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)路線（1）建立高頻組培再生體系（2）構(gòu)建適合的表達(dá)載體（3）選擇適合的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化（4）選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（5）轉(zhuǎn)化植株再生（6）轉(zhuǎn)基因植株鑒定2.3.1植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)（1）愈傷組織再生系統(tǒng)（2）直截了當(dāng)分化再生系統(tǒng)（3）原生質(zhì)體再生系統(tǒng)（4）胚狀體再生系統(tǒng)（5）生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)2.3.2植物轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記基因須具備4個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測(cè)容易，并能定量分析。最常用的是抗生素抗性基因和編碼催化人工底物形成熒光物質(zhì)的酶基因。(1)抗生素類(lèi)選擇標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Neomycinephosphptransferase-II，NptII)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chloraphenicolacetyltransferase，Cat)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphortransferase，Hpt)基因等。NptII基因應(yīng)用最廣泛。它編碼的產(chǎn)物對(duì)某些氨基葡糖苷類(lèi)抗生素，如卡那霉素、新霉素等具有抗性。用卡那霉素（Kanamycin）、新霉素作為選擇性物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，可對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行選擇。(2)除草劑類(lèi)選擇標(biāo)記基因Bialaphos抗性基因（Bar）來(lái)源于細(xì)菌(Streptnyceshysroscpicus)，編碼草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶使除草劑草甘磷失去活性。35S-Bar在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，可對(duì)這些植物中的草甘膦和Bialaphos產(chǎn)生高水平抗性。用Bar基因作為選擇標(biāo)已在一些植物上獲得成功。(3)GUS基因即β-葡萄糖苷酸酶基因。利用轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酸酶，催化裂解人工合成的底物4-甲基傘形酮基-葡萄糖酸苷時(shí)，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮，因而能夠熒光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。此方法測(cè)定容易、迅速，并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)刻內(nèi)測(cè)定。GUS基因被廣泛使用于植物基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，專(zhuān)門(mén)是在進(jìn)行外源基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中。(4)熒光素酶基因熒光素酶（Luciferase,Luc）是生物體催化自身發(fā)光的一種蛋白質(zhì)，在激活劑Mg2+作用下，與底物熒光素、ATP、O2反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素酰化合物。該化合物經(jīng)氧化脫羧成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，同時(shí)發(fā)射光子，最大發(fā)射波長(zhǎng)是562nm，能夠用微光測(cè)定儀檢測(cè)到專(zhuān)門(mén)柔弱的熒光素酶分子。Luc基因可作為報(bào)告基因，通過(guò)測(cè)定熒光素酶的表達(dá)，檢測(cè)各種啟動(dòng)子的活性，測(cè)定與Luc基因嵌合的目的基因的表達(dá)情形，也能夠研究真核生物基因的調(diào)控序列和基因的組織特異性表達(dá)。Luc基因檢測(cè)十分迅速，高靈敏度，具有作為報(bào)告基因的最佳條件。2.3.3植物轉(zhuǎn)基因的方法按是否需要通過(guò)組織培養(yǎng)再生植株分成兩大類(lèi)：1）需要通過(guò)組織培養(yǎng)再生植株，常用方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；2）不需要通過(guò)組織培養(yǎng)，目前比較成熟的要緊有花粉管通道法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞最成功和應(yīng)用最為廣泛的方法。2.3.3植物轉(zhuǎn)基因的方法①載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法即屬于這一類(lèi)方法；②DNA的直截了當(dāng)導(dǎo)入法，即利用植物細(xì)胞的生物學(xué)特性，通過(guò)物理、化學(xué)等方法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞的技術(shù)。物理方法有基因槍法、電激法、超聲波法、顯微注射法、激光微束法等。化學(xué)方法有PEG法和脂質(zhì)體法等。③種質(zhì)系統(tǒng)法，包括花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法、胚囊和子房注射法等。2.3.3植物轉(zhuǎn)基因的方法（1）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法整株感染法、葉圓片法、原生質(zhì)體法、替代性轉(zhuǎn)化法。（2）基因槍法又稱生物彈法、微粒槍法、微粒轟擊法，是依靠高速金屬微粒將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。該法是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后又一應(yīng)用較廣的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。在單子葉植物中應(yīng)用較多。2.3.3植物轉(zhuǎn)基因的方法（3）電激法也稱電擊穿孔法，利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”，細(xì)胞膜上會(huì)顯現(xiàn)短暫可逆性開(kāi)放小孔，從而能夠外源DNA。（4）PEG法將原生質(zhì)體懸浮于含有質(zhì)粒DNA的PEG溶液中，通過(guò)PEG的作用，使質(zhì)粒DNA加入原生質(zhì)體，隨機(jī)整合細(xì)胞的基因組中。2.3.3植物轉(zhuǎn)基因的方法（5）花粉管通道法使外源DNA沿花粉管滲入，通過(guò)珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚未具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。（6）激光微束穿刺法（7）超聲波轉(zhuǎn)化法（8）浸泡法（9）子房照耀法（10）其它方法低能離子束法，顯微注射法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法。2.3.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，能在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌（A.rhizogenes）含有Ri質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒有一段T-DNA，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，可將T-DNA插入植物基因組中。將目的基因插入到通過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。2.3.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一樣過(guò)程：①將目的基因?qū)牍舱陷d體或雙元載體；②將帶有目的基因的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌；③使農(nóng)桿菌感染寄主（受體）植物細(xì)胞；④選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞并誘導(dǎo)其再生植株；⑤對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定。2.3.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(1)植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)的建立通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，建立能高效、穩(wěn)固地再生無(wú)性系，并能同意外源DNA整合，轉(zhuǎn)化選擇對(duì)抗生素敏銳的再生系統(tǒng)。(2)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建共整合載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)(3)目的基因轉(zhuǎn)化與抗性植株的再生①無(wú)菌受體材料選擇子葉、胚軸、葉片、莖段等都可作為受體材料。②受體材料的預(yù)培養(yǎng)將受體材料切成適宜大小，置于愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2～3d，材料切口處剛開(kāi)始膨大時(shí)即可進(jìn)行接種侵染。(3)目的基因轉(zhuǎn)化與抗性植株的再生③供體菌株培養(yǎng)挑取平板上的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種到20ml含有抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基（pH7.0）中。將培養(yǎng)瓶置于27℃，180r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，一樣過(guò)夜培養(yǎng)即可。取OD600為0.6～0.8農(nóng)桿菌菌液，按1%～2%比例轉(zhuǎn)入新配制的無(wú)抗生素的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，180r/min恒溫?fù)u床上27℃培養(yǎng)6h左右，OD600為0.2～0.5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化，或同時(shí)加入100～500μmol/L的AS。(3)目的基因轉(zhuǎn)化與抗性植株的再生④侵染將無(wú)菌外植體放入菌液中，浸泡適當(dāng)時(shí)刻，一樣1～5min。取出外植體，置于無(wú)菌濾紙上，吸去余外的菌液。⑤共培養(yǎng)將侵染過(guò)的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2～4天。具體時(shí)刻依植物不同而異。⑥脫菌及選擇培養(yǎng)將經(jīng)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的選擇及脫菌培養(yǎng)基上，25～28℃光照條件下培養(yǎng)2～3天。轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出不定芽或產(chǎn)生抗性愈傷組織。(3)目的基因轉(zhuǎn)化與抗性植株的再生⑦繼代與生根培養(yǎng)將抗性芽轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中繼代擴(kuò)繁，或是將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。不定芽長(zhǎng)到1cm以上時(shí)，切下不定芽，轉(zhuǎn)入含選擇壓的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。(4)抗性再生幼苗的移栽抗性再生幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其從培養(yǎng)基中取出，用無(wú)菌水洗凈瓊脂，移入消過(guò)毒的土壤。前一兩周應(yīng)保持較高濕度，此后逐步降低濕度至與正常溫室條件一致，在溫室中連續(xù)培養(yǎng)。幾點(diǎn)注意事項(xiàng)1)外植體材料以葉片、子葉、胚軸為首選。盡量選用幼年的外植體。2)切割外植體時(shí)，應(yīng)使分生組織暴露，即在分生組織處切割，以增加農(nóng)桿菌與分生組織的接種面積。3)外植體的切口應(yīng)與培養(yǎng)基較好地接觸，可使用一些較軟的培養(yǎng)基，小心地將切口的邊緣組織壓進(jìn)培養(yǎng)基中，如此有利于愈傷組織形成。4)用葉片作為外植體時(shí)，應(yīng)幸免切葉片中央的主脈，因?yàn)橹髅}細(xì)胞不易轉(zhuǎn)化。幾點(diǎn)注意事項(xiàng)5)外植體在菌液中的浸泡時(shí)刻：太短，農(nóng)桿菌尚未接種到傷口面，不能轉(zhuǎn)化；太長(zhǎng)，外植體常因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐。一樣不要超過(guò)30min。6)浸泡后用濾紙吸去余外菌液時(shí)要適度，如果外植體暴露時(shí)刻太長(zhǎng)會(huì)造成失水萎蔫，而且吸得太干共培養(yǎng)時(shí)切口面無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。7)適宜的共培養(yǎng)時(shí)刻：過(guò)短，農(nóng)桿菌不能充分侵染切口細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率低；過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)過(guò)多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化外植體死亡。8)培養(yǎng)基中抗生素選擇劑量因外植體不用而異。劑量太大，不利于轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率偏低；而太低，則導(dǎo)致假陽(yáng)性太多，給分子檢測(cè)帶來(lái)苦惱。無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)植物轉(zhuǎn)基因通常利用抗生素類(lèi)、除草劑類(lèi)及有毒物質(zhì)基因作為選擇標(biāo)記，選擇轉(zhuǎn)化體。獲得轉(zhuǎn)基因植株后，選擇標(biāo)記基因就失去存在的價(jià)值，連續(xù)表達(dá)的產(chǎn)物會(huì)帶來(lái)一些不良后果。要緊表現(xiàn)在：(1)選擇劑阻礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化；(2)關(guān)于選擇標(biāo)記基因?qū)】岛铜h(huán)境的阻礙咨詢題尚沒(méi)有定論，阻礙轉(zhuǎn)基因植物投入市場(chǎng)；(3)由于現(xiàn)有可利用的選擇標(biāo)記基因有限，應(yīng)用相同的選擇標(biāo)記基因向植物疊加外源基因存在一定的困難。解決這一咨詢題的全然途徑:剔除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因。（1）無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得1）共轉(zhuǎn)化法（co-transformation）同時(shí)使用2個(gè)獨(dú)立的DNA載體（分不含有目的基因、選擇標(biāo)記基因），對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)2個(gè)基因分不整合在受體的不同染色體上時(shí)，轉(zhuǎn)化植株后代經(jīng)有性時(shí)期的分離重組，選擇標(biāo)記基因與目的基因分離，即可獲得只含有目的基因而不帶選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植株，從而達(dá)到去除標(biāo)記基因的目的。不同轉(zhuǎn)化載體中的轉(zhuǎn)基因共整合頻率往往較低，且常整合在同一位點(diǎn)，造成基因連鎖，使得共轉(zhuǎn)化的應(yīng)用受到了限制。解決方法：雙T-DNAs系統(tǒng)（超級(jí)雙元載體），立即分不帶有目的基因和選擇標(biāo)記基因的兩個(gè)T-DNA裝載在同一個(gè)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，能較大地提升共轉(zhuǎn)化頻率。（1）無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得2）位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)（site-specificrecombinationsystem）利用重組酶催化兩個(gè)短的、特定DNA序列間的重組，以去除選擇標(biāo)記基因。目前，應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的重組酶系統(tǒng)要緊有Cre/loxP系統(tǒng)、FLP/FRTs系統(tǒng)、和R/RS系統(tǒng)等。（1）無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得3）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)通過(guò)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入的基因能夠在基因組中重新定位。Ac/Ds和Spm/dSpm是研究得最深的兩個(gè)轉(zhuǎn)座子家族。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可被開(kāi)發(fā)用于轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來(lái)培養(yǎng)安全無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株?？捎脙煞N方法實(shí)現(xiàn)：a）標(biāo)記基因被置于轉(zhuǎn)座子與重復(fù)序列Ds之間，轉(zhuǎn)座作用發(fā)生后，標(biāo)記基因即隨轉(zhuǎn)座作用而跟目的基因分離或丟失；b）將目的基因置于Ds之間，目的基因?qū)㈦S轉(zhuǎn)座作用的發(fā)生而與選擇標(biāo)記基因分離。（2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得使用安全標(biāo)記基因作選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理：不將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，而是轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠借助熒光顯微鏡活體檢測(cè)，或在一定程度上使轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于某個(gè)有利的代謝條件下，從而選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。傳統(tǒng)的選擇系統(tǒng)稱為負(fù)選擇系統(tǒng)，相應(yīng)地這種選擇系統(tǒng)稱之為正選擇系統(tǒng)。正選擇系統(tǒng)的要緊優(yōu)點(diǎn)在于選擇劑無(wú)毒副作用，而且在多數(shù)情形下有利于轉(zhuǎn)化植株的再生，從而提升轉(zhuǎn)化率。（2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得目前，有應(yīng)用前景的安全標(biāo)記基因要緊包括一些無(wú)毒性的化學(xué)物質(zhì)或與植物生長(zhǎng)有關(guān)的蛋白基因，如GUS基因（β-半乳糖葡萄糖醛酸酶）GFP基因（綠色熒光蛋白）木糖異構(gòu)酶基因甘露糖－6－磷酸異構(gòu)酶基因異戊烯轉(zhuǎn)移酶Ipt基因發(fā)根農(nóng)桿菌Rol基因（2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得按照植物細(xì)胞對(duì)不同糖類(lèi)碳源的代謝能力，利用糖類(lèi)作為選擇劑的正選擇系統(tǒng)，顯示出龐大的應(yīng)用潛力。這類(lèi)標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是某種糖類(lèi)的分解代謝酶，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能利用選擇劑糖類(lèi)作為要緊碳源，可在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則處于饑餓狀態(tài)，生長(zhǎng)被抑制但不被殺死，依此能夠區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此外，干擾氨基酸代謝的選擇方法也慢慢進(jìn)展起來(lái)，顯示出了誘人的前景。2.3.5轉(zhuǎn)基因植株的鑒定轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（Potrykus，1991）（1）要設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)比（包括陽(yáng)性和陰性對(duì)比）；（2）提供轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株的外源基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)，包括物理數(shù)據(jù)（PCR、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、Western印跡雜交等）與表型數(shù)據(jù)（酶活性分析或其它）；（3）提供外源基因操縱的表型性狀證據(jù)（如抗蟲(chóng)）；（4）按照該植物的繁育方式（有性或無(wú)性），提供穩(wěn)固遺傳證據(jù)，有性繁育植物需要有目的基因操縱的表型性狀傳遞給后代的證據(jù)，無(wú)性繁育植物需要有繁育一代穩(wěn)固遺傳的證據(jù)。因此，要獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，在轉(zhuǎn)基因操作后，要做如下四步：2.3.5轉(zhuǎn)基因植株的鑒定（1）選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在選擇壓力下再生轉(zhuǎn)化植株。（2）對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，即Southern印跡雜交證明外源基因在植物染色體的整合，Southern原位雜交證明外源基因在染色體賞的整合位點(diǎn)，Northern印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄，生成特異mRNA，Western印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄及翻譯生產(chǎn)特異蛋白質(zhì)。（3）進(jìn)行性狀鑒定及外源基因的表達(dá)調(diào)控研究。（4）遺傳分析，證明轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)固性，并獲得轉(zhuǎn)基因植物品種，應(yīng)用于生產(chǎn)。2.3.5.1外源基因整合的鑒定（1）PCR檢測(cè)（2）Southern印跡雜交（3）DNA芯片技術(shù)（1）PCR檢測(cè)PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReaction）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制合成過(guò)程，在體外進(jìn)行的特異性擴(kuò)增某DNA片段的方法。PCR的原理：利用DNA聚合酶能夠以引物3’-OH為起點(diǎn)，催化dNTP按模板順序，合成互補(bǔ)鏈。是一種體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片斷的核酸合成技術(shù)。此方法簡(jiǎn)便快捷，已成為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的有效技術(shù)之一。（1）PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)包括3個(gè)差不多步驟：①變性(denaturation)：雙鏈DNA在94℃下熱變性，解離成單鏈。②退火(annealling)：溫度突然降到引物Tm值以下時(shí)，引物與模板DNA互補(bǔ)序列雜交。因模板DNA分子結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比引物復(fù)雜，且反應(yīng)體系中引物的摩爾數(shù)遠(yuǎn)大于模板DNA，故在退火溫度下引物與模板DNA分子可形成互補(bǔ)雜交鏈，而單鏈模板DNA間互補(bǔ)形成雙鏈的機(jī)會(huì)少得多。③延伸(extension):在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶依靠其5′→3′的聚合酶活力，以引物為起始，互補(bǔ)的DNA鏈為模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互補(bǔ)鏈。（1）PCR檢測(cè)通過(guò)變性、退火、延伸3個(gè)溫度的循環(huán)，模板上介于兩引物之間的片段持續(xù)擴(kuò)增。目的片段以2n形式積存，經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)后，目的片段的DNA量可達(dá)到106倍。PCR檢測(cè)時(shí)，以被檢組織DNA為模板，以外源基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。若被檢植株基因組中含有外源基因，則可得到擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠上就會(huì)顯現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，反之則無(wú)。（1）PCR檢測(cè)檢測(cè)的程序：1）引物設(shè)計(jì)按照外源基因兩端的序列，使用OLIGO或PrimerSelect等軟件設(shè)計(jì)引物。也可采納較簡(jiǎn)單有效的方法得到引物，即以目的基因5′端20個(gè)堿基序列做5′引物，以該基因3′端20個(gè)堿基順序的互補(bǔ)序列做3′端引物（被檢基因的序列已知）。（1）PCR檢測(cè)2）模板DNA的制備①稱5~10mg供試材料，置Eppendorf管中，加入50～100ulNaOH(0.5mol/L)，用玻璃棒研碎，靜置片刻。②少許離心，獵取上清液。③取5ul上清液轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中，加入Tris緩沖液（100mmol/Ltris，pH8.0）至50～500ul，備用。此法要緊用于PCR大量快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物。有些植物以此法提取的DNA為模板，就可獲得較好的PCR擴(kuò)增成效。而有些植物需要采納較為復(fù)雜的總DNA提取方法（如CTAB法）以獲得純度較高的DNA模板。（1）PCR檢測(cè)3）反應(yīng)體系的建立①在0.5ml無(wú)菌硅化的Eppendorf管中，分不加入轉(zhuǎn)基因植物總DNA、陰性對(duì)比植物總DNA、陽(yáng)性對(duì)比DNA（含被檢基因的質(zhì)粒）為反應(yīng)模板。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)空白對(duì)比即無(wú)DNA模板的對(duì)比和無(wú)引物的對(duì)比。②依次加入反應(yīng)成分：（1）PCR檢測(cè)（1）PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中含50mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl（室溫下pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2。③預(yù)變性。將上述成分混勻后于94℃變性10min。取出離心管，臺(tái)式離心機(jī)上快速離心幾秒鐘，使冷凝于管蓋上的液體回到管底。④加入TaqDNA聚合酶，在預(yù)變性后的反應(yīng)成分混合液中加入1ulTaqDNA聚合酶（約1～3U），混勻。⑤最后加入1滴礦物油（約50ul）于管中，防止反應(yīng)循環(huán)中水分的蒸發(fā)。（1）PCR檢測(cè)4）循環(huán)參數(shù)的設(shè)定①94～95℃變性30～60s。②58～60℃退火1min(據(jù)各個(gè)引物最佳退火溫度調(diào)整)。③72℃延伸1～2min，循環(huán)25～40次（依不同基因預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果而定）。④72℃延伸7～10min。⑤循環(huán)終止。（1）PCR檢測(cè)5）電泳檢測(cè)①取各樣品反應(yīng)物5～20ul點(diǎn)樣，0.8%～2%瓊脂糖電泳分離，50～100V電泳1h。②紫外燈下觀看結(jié)果并照相。如果有必要，能夠把特異帶切下來(lái)，用同等的PCR反應(yīng)條件，適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積進(jìn)行再擴(kuò)增。（2）Southern印跡雜交差不多原理：將基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，堿處理使酶切片段在凝膠上原位變性。利用印跡技術(shù)將變性的酶切片段原位轉(zhuǎn)移到固相膜上，經(jīng)烘干或紫外線照耀處理固定。預(yù)雜交處理掩蓋膜上的非特異性雜交位點(diǎn)。加入含有單鏈探針的雜交液，在適宜條件下雜交。膜上存在的與探針互補(bǔ)的單鏈序列，可提供堿基互補(bǔ)作用與探針雜交形成雙鏈，從而使探針固定在相應(yīng)的位置上，并按照探針的標(biāo)記性質(zhì)采納相應(yīng)的方法檢測(cè)出來(lái)，例如，若使用放射性標(biāo)記探針，則可通過(guò)放射性自顯影而被檢測(cè)出來(lái)。（2）Southern印跡雜交差不多步驟：①被檢植物的DNA提??；②雜交探針制備；③DNA樣品酶切；④電泳；⑤變性；⑥印跡；⑦雜交；⑧雜交結(jié)果的檢出。2.3.5.2外源基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)（1）Northern雜交（2）RT-PCR等。二者都只能檢測(cè)目的基因是否表達(dá)，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定RNA表達(dá)量，而且操作復(fù)雜。（3）實(shí)時(shí)定量PCR（real-timefluorescentquantitativePCR），近年興起的核酸定量檢測(cè)技術(shù)，可較準(zhǔn)確地測(cè)定目的基因RNA表達(dá)量。Northern印跡雜交差不多步驟：①被檢植物的總RNA提?。虎谔结樦苽?；③印跡；④雜交；⑤雜交結(jié)果檢出。2.3.5.3外源基因翻譯水平的檢測(cè)（1）Gus檢測(cè)（2）Western雜交（3）ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentassay)（1）Gus檢測(cè)差不多原理：gus基因(β-葡萄糖甘酸酶基因)是植物基因工程中應(yīng)用較為廣泛的報(bào)告基因，編碼β-葡萄糖甘酸酶。該酶與5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖甘酸酯（簡(jiǎn)寫(xiě)X-Gluc）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀反應(yīng)。既能夠用分光光度計(jì)法測(cè)定，又能夠直截了當(dāng)觀看到植物組織由沉淀形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。檢測(cè)容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)刻內(nèi)測(cè)定完畢。（1）Gus檢測(cè)差不多步驟：（1）藥品配制（2）染色及觀看第一步，將葉片、莖等植物材料制成徒手切片（1～3mm厚）或剪成小塊、小片。第二布，染色、觀看。（1）Gus檢測(cè)直截了當(dāng)染色法a)將植物材料放入Eppendorf管中，加染液浸沒(méi)材料。b)37℃水浴中浸育1h至過(guò)夜。c)如有必要，可將浸染過(guò)的材料轉(zhuǎn)入70%或95%乙醇中脫色（除去葉綠素）2～3次，至陰性對(duì)比材料呈白色為止。也可在FAA固定脫色液中脫色。d)肉眼或顯微鏡下觀看，白色背景上的藍(lán)色沉淀小點(diǎn)即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。（1）Gus檢測(cè)固定染色法a)將材料浸入固定液，必要時(shí)可抽真空1min，室溫下輕搖30～60min。b)取出材料，用磷酸鈉緩沖液漂洗3～4次。c)取出材料放入Eppendorf管中，加入染色液浸沒(méi)材料，蓋上管蓋。d)37℃溫箱中溫育幾分鐘至過(guò)夜。e)取出材料，用75%乙醇漂洗，或放入FAA液中脫色20min。f)依次用20%乙醇、50%乙醇浸泡材料各20min。g)顯微鏡下觀看，白色背景下的藍(lán)色斑點(diǎn)極為Gus表達(dá)位點(diǎn)。h)染色后的材料可浸入含80%乙醇的FAA液中儲(chǔ)存。（2）Western雜交差不多步驟：①被檢植株蛋白質(zhì)的提??；②SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)；③蛋白質(zhì)條帶印跡；④探針制備；⑤雜交；⑥雜交結(jié)果檢出。（3）ELISAELISA是將抗體或抗原包被在固相載體上后，采納酶標(biāo)記，抗體與抗原的結(jié)合通過(guò)酶反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直截了當(dāng)有關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。ELISA可用于特異性選擇植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品組分中的非降解蛋白質(zhì)。此方法靈敏性高，用時(shí)短，費(fèi)用低，適用于對(duì)非變性蛋白質(zhì)的大量分析。Werstern雜交可定性檢測(cè)出目的基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)，而ELISA則能夠定量地檢測(cè)出目的蛋白質(zhì)的含量，因此，兩者經(jīng)常被聯(lián)合使用。2.4基因工程與林木遺傳改良2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程2.4.2林木抗病基因工程2.4.3林木抗除草劑基因工程2.4.4林木抗逆基因工程2.4.5木材改良基因工程2.4.6生殖與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控基因工程2.4.7花型花色有關(guān)基因工程2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程抗蟲(chóng)基因要緊有：蘇云金桿菌毒蛋白基因（Bt基因）蛋白酶抑制劑基因（PI基因）淀粉酶抑制劑基因外源凝集素基因以及昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素基因，等等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物都具有相當(dāng)?shù)臍⑾x(chóng)活性并具有一定的專(zhuān)一性，對(duì)人及其他哺乳動(dòng)物并不構(gòu)成危害。2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程1987年，馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因（Pin-II）導(dǎo)入楊樹(shù)NC5399無(wú)性系。隨后，銀白楊×大齒楊和歐洲黑楊×毛果楊（P.deltoides×P.trichocarpa）雜種，獲得抗舞毒蛾和天幕毛蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株。1994年Shin利用發(fā)根農(nóng)桿菌成功將Bt基因?qū)肼淙~松。在國(guó)內(nèi)，自從將對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有毒性的Bt毒蛋白基因?qū)霘W洲黑楊（P.deltoides）并獲得轉(zhuǎn)基因植株以來(lái)，在歐洲黑楊和毛白楊的抗蟲(chóng)基因遺傳轉(zhuǎn)化上做了大量的研究。已成為楊樹(shù)抗蟲(chóng)基因工程研究較早的國(guó)家之一，目前獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)已相繼進(jìn)入大田試驗(yàn)和商品化生產(chǎn)時(shí)期。2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程轉(zhuǎn)Bt基因的樹(shù)種有：楊樹(shù)、蘋(píng)果、核桃、落葉松、花旗松、火炬松、歐洲黑楊、云杉等。開(kāi)始將多個(gè)不同類(lèi)型的基因?qū)肓帜镜难芯俊：颖鞭r(nóng)業(yè)大學(xué)將部分改造BtCryIAc基因與慈菇蛋白酶抑制劑基因構(gòu)建的雙抗蟲(chóng)基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了優(yōu)良白楊雜種741楊［PopulusalbaL.×(P.davidianaDode＋P.simoniiCarr.)×P.tomentosaCarr.］，獲得一批對(duì)多種鱗翅目害蟲(chóng)具有高抗蟲(chóng)性株系。中國(guó)林科院用農(nóng)桿菌介導(dǎo)二次轉(zhuǎn)化法，將PI基因?qū)牒珺t基因的歐洲黑楊，抗蟲(chóng)能力明顯高于僅含Bt基因的植株。2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程2.4.1林木抗蟲(chóng)基因工程昆蟲(chóng)的抗性演化操縱策略：（1）基因啟動(dòng)子及基因表達(dá)策略。采納特異性的啟動(dòng)子，使目的基因在適當(dāng)?shù)臅r(shí)刻和特定的組織進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)各種途徑提升殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)量和含量；（2）基因策略。聯(lián)合使用兩種或兩種以上不同殺蟲(chóng)機(jī)制的抗蟲(chóng)基因，使轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)數(shù)個(gè)具有不同毒性機(jī)制的毒素。Bt毒素基因與其他抗蟲(chóng)基因（如PI、Lectin、Vip基因等）同時(shí)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中，其抗蟲(chóng)性及防止昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的能力將會(huì)大大提升。（3）“避難所”策略。在高水平表達(dá)毒蛋白的轉(zhuǎn)基因林分中種植部分非抗蟲(chóng)的同類(lèi)樹(shù)木作為“避難所”，如此只有抗性純合體昆蟲(chóng)才能在林中存活，而敏銳昆蟲(chóng)只能在“避難所”存活。如果能夠通過(guò)某種機(jī)制吸引（或強(qiáng)迫）抗性純合體和敏銳昆蟲(chóng)在“避難所”交配，那么其雜合體后代都將被抗蟲(chóng)植物毒害致死。2.4.2林木抗病基因工程番木瓜、柑桔、葡萄、香蕉、杏和櫻桃等果樹(shù)上獲得了轉(zhuǎn)基因植株?？共《巨D(zhuǎn)基因番木瓜已被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)(美國(guó))。2.4.2林木抗病基因工程目前使用的抗病毒基因有楊樹(shù)花葉病毒外殼蛋白（PMVCP）基因、洋李痘病毒的外殼蛋白（PPV）基因和黃瓜花葉病毒外殼蛋白（CMVCP）基因等少數(shù)幾種。英國(guó)牛津大學(xué)克隆了楊樹(shù)花葉病毒外殼蛋白基因，將其轉(zhuǎn)化楊樹(shù)并獲得成功。Scorza等（1992）將番木瓜（CariapapayaL.）環(huán)斑病毒（PRV）外殼蛋白基因?qū)霘W洲李中。Camara等（1995）把洋李痘病毒的外殼蛋白（PPV）基因分不導(dǎo)入李和杏中，獲得了較好的抗PPV特性。2.4.2林木抗病基因工程2001年Liang等今后自小麥的草酸氧化酶基因?qū)霔顦?shù)，提升了轉(zhuǎn)基因植株的抗真菌能力。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從兔子體內(nèi)克隆的防備素基因?qū)朊讞睿≒.tomentosaCarr.），轉(zhuǎn)基因植株組織提取液對(duì)枯草桿菌、農(nóng)桿菌和立枯病原菌等多種微生物的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。此外，利用次生代謝產(chǎn)物的抗病作用將矮牽牛黃酮合成酶CHSA基因?qū)霔顦?shù)，提升了楊樹(shù)的抗病性。將過(guò)氧化物酶基因?qū)霔飨?LiquidambarstyracifluaL.)，獲得抗病的轉(zhuǎn)基因植株。將Glu和Chi基因轉(zhuǎn)入歐洲板栗(CastaneasativeMill.)，提升了對(duì)樟疫霉真菌病害的抗性。中國(guó)林科院將一種抗菌肽基因轉(zhuǎn)入美洲黑楊并通過(guò)了分子生物學(xué)檢測(cè)。2.4.3林木抗除草劑基因工程抗除草劑基因（1）除草劑的降解和解毒基因。如乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因、水解酶基因、超氧化物岐化酶基因。（2）靶蛋白抗性基因。如抗EPSP抑制劑基因（aroA基因）、抗ALS抑制劑基因（ALS基因）。2.4.3林木抗除草劑基因工程Fillatti（1987年）將抗除草劑基因(AroA基因)轉(zhuǎn)入楊樹(shù)NC5339無(wú)性系中，獲得一批抗除草劑(草甘磷)轉(zhuǎn)化植物。1987年美國(guó)首次將抗除草劑基因?qū)脬y白楊與大齒楊的雜種無(wú)性系中并進(jìn)入田間試驗(yàn)，隨后又成功地將抗除草劑的基因轉(zhuǎn)入美洲黑楊、落葉松中，引發(fā)了一場(chǎng)轉(zhuǎn)基因工程的熱潮。目前黑挪威云杉、輻射松和挪威云杉等樹(shù)種也獲得轉(zhuǎn)基因抗除草劑植株，闊葉樹(shù)種中，赤桉也獲得了抗高劑量廣譜除草劑Liberty的轉(zhuǎn)化系。目前已獲得并利用的抗除草劑基因有PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、草甘磷氧化還原酶基因、鼠傷寒沙門(mén)氏菌EPSP突變基因、煙草ALS突變基因，工系統(tǒng)IIQB蛋白突變基因、2，4-D單氧化酶基因等。2.4.4林木抗逆基因工程研究要緊集中以下幾個(gè)方面：①導(dǎo)入編碼催化產(chǎn)生的滲透調(diào)劑物的酶基因；②導(dǎo)入清除活性氧的酶基因；③導(dǎo)入AFP(antifreezingprotein)蛋白基因的研究；④導(dǎo)入脫水愛(ài)護(hù)物質(zhì)合成基因；⑤導(dǎo)入編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)劑基因。2.4.4林木抗逆基因工程抗逆基因（1）抗凍蛋白(antifreezeprotein，AFP)基因（2）脂肪酸去飽和酶基因，如擬南芥葉綠體中的ω-3脂肪酸脫氫酶基因fad7、酵母的Δ-9脂肪酸去飽和酶基因。（3）抗?jié)B透脅迫基因(滲透調(diào)劑物質(zhì)合成酶基因)，如脯氨酸合成酶基因、果聚糖合成酶基因。2.4.4林木抗逆基因工程植物在抗擊逆境脅迫過(guò)程中，多種基因得以誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因是受逆境脅迫產(chǎn)生的信號(hào)調(diào)劑。逆境脅迫產(chǎn)生的信號(hào)可能是作用于某些共同的調(diào)控因子，再由這些調(diào)控因子來(lái)操縱受鹽脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)。目前已發(fā)覺(jué)一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能同受鹽或洪澇脅迫調(diào)控基因的啟動(dòng)子相結(jié)合。如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DREB1A與脫水敏銳因子DRE（dehyrationresponseelement）。DRE是調(diào)控許多對(duì)洪澇、鹽脅迫和低溫等脅迫敏銳基因啟動(dòng)子的順式作用成分。使DREB1A基因在植物中過(guò)量表達(dá)，許多與抗這些脅迫有關(guān)的基因在正常生長(zhǎng)條件下獲得誘導(dǎo)表達(dá)，與對(duì)比相比，植物對(duì)這些脅迫的抵御力也相應(yīng)增強(qiáng)。2.4.5木材品質(zhì)改良基因工程改良木質(zhì)素基因木質(zhì)素是植物中的一類(lèi)苯丙烷衍生物的高聚物，是細(xì)胞壁的重要組成部分。制漿造紙中，用化學(xué)方法去除木質(zhì)素，消耗大量能量，還造成嚴(yán)峻的環(huán)境污染。木質(zhì)素生物合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因，包括CAD（肉桂醇脫氫酶）、COMT(咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶)、PAL（L-苯丙氨酸裂解酶）和C4H(肉桂酸脫氫酶)基因，木質(zhì)素基因工程已達(dá)到了降低木質(zhì)素含量、改善木質(zhì)素組分的目的。2.4.5木材品質(zhì)改良基因工程CAD催化木質(zhì)素單體形成的最后一步，在整個(gè)木質(zhì)素合成途徑中起關(guān)鍵作用。將從毛果楊×美洲黑楊(Populustrichocarpa×P.deltoides)分離出來(lái)的反義CAD基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)(歐洲山楊×銀白楊，P.tremula×P.alba)，木質(zhì)部中CAD活性減少70%。4CL是催化羥基肉桂酸形成G或S型單體途徑中的關(guān)鍵酶。將反義4CL基因轉(zhuǎn)入三倍體毛白楊(P.tomentosa)，木質(zhì)素含量比對(duì)比下降41.73%，總纖維素含量無(wú)明顯差不。2.4.5木材品質(zhì)改良基因工程COMT要緊參與S木質(zhì)素的生物合成，CCoAOMT參與S和G木質(zhì)素的生物合成。G木質(zhì)素在紙漿生產(chǎn)中專(zhuān)門(mén)難去除，針葉樹(shù)中僅含G木質(zhì)素，難用于紙漿生產(chǎn)。利用反義RNA技術(shù)，抑制COMT和CCoAOMT基因的表達(dá)，可調(diào)整木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降低木質(zhì)素含量，且這種適當(dāng)降低，不阻礙植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。利用COMT和CCoAOMT調(diào)控木質(zhì)素的生物合成途徑，以培養(yǎng)低木質(zhì)素含量的用材樹(shù)品種，具有較大的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。2.4.6林木生長(zhǎng)性狀改良基因工程通過(guò)基因工程調(diào)劑內(nèi)源激素平穩(wěn)、改良木材生長(zhǎng)性狀?；蛞o有：來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的iaaM、iaaH基因，來(lái)自發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的rolA、B、C基因。許多研究表明,將rolA、B、C基因轉(zhuǎn)入植物，不僅可促進(jìn)根的形成和發(fā)育，同時(shí)對(duì)促使轉(zhuǎn)基因植株的地上部分的生長(zhǎng)、發(fā)育和其他性狀的改變也有一定的作用。Strobel等(1987)將發(fā)根農(nóng)桿菌與橄欖樹(shù)實(shí)生苗共培養(yǎng)，可促進(jìn)實(shí)生苗生根和莖的伸長(zhǎng)，提升開(kāi)花率、結(jié)實(shí)率和產(chǎn)油率。2.4.6林木生長(zhǎng)性狀改良基因工程N(yùn)ilsson等(1996)和Tzfira等(1998)研究表明,轉(zhuǎn)rolA或B或C基因的雜種楊樹(shù)生長(zhǎng)和發(fā)育速度、生根能力均發(fā)生改變。其中，轉(zhuǎn)rolC基因的楊樹(shù)頂端優(yōu)勢(shì)降低、植株矮化和節(jié)間縮短,內(nèi)源激素含量下降、赤霉素合成發(fā)生變化,而細(xì)胞分裂素水平卻升高。因此，可通過(guò)轉(zhuǎn)rolC基因選育矮化砧木,對(duì)林木種子園治理有重要意義。Tzfira等(1997)發(fā)覺(jué)將rolA、B、C基因置于它們自身的啟動(dòng)子調(diào)控下,轉(zhuǎn)rolABC基因楊樹(shù)生長(zhǎng)速度提升、生根能力增強(qiáng)、莖:根生產(chǎn)量指數(shù)提升、抑制腋芽生成,同時(shí)在第一和第二個(gè)冬天推遲休眠(Tzfiraetal.,1999)。這可能是因?yàn)閞olA、B、C基因在自身啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)量較低,而這種轉(zhuǎn)基因林木表型的改變正符合育種目標(biāo)。2.4.6林木生長(zhǎng)性狀改良基因工程至今已成功地利用Ri質(zhì)粒及其各種Rol基因?qū)γ讞?、雜交楊、刺槐、蘋(píng)果、松樹(shù)、柑橘、油橄欖、彌猴桃及月季等十幾種林木進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，均獲得生根能力明顯提升的轉(zhuǎn)基因植株。Ri質(zhì)粒Rol基因轉(zhuǎn)化的植株不僅表現(xiàn)出生根能力明顯提升，而且通常還表現(xiàn)出葉片和花的形狀、色素形成、節(jié)間長(zhǎng)短、生活周期及向地性等性狀的可遺傳變異，為培養(yǎng)具有更高觀賞價(jià)值的新品系提供選擇基礎(chǔ)。2.4.7林木發(fā)育有關(guān)基因工程（1）不育基因核糖核酸酶（RNase）基因。具有酶切RNA的作用，編碼RNase的2個(gè)基因RNaseT1和Barnase基因已被克隆。把RNase基因和植物花藥絨氈層特異表達(dá)啟動(dòng)子相連接，然后導(dǎo)入植物，就能導(dǎo)致植物雄性不育擬南芥的Ag基因、煙草的TA29基因、金魚(yú)草的tap2基因差不多上絨氈層特異表達(dá)基因。2.4.7林木發(fā)育有關(guān)基因工程（2）不育基因chs反義基因。該基因可導(dǎo)致雄性不育，但雌性可育。此外，目前已有許多與花粉或花藥發(fā)育有關(guān)的基因被克隆，如pTA29-barnase基因、pA3-β-1,3-葡聚糖酶基因，這些基因均可通過(guò)反義RNA途徑獲得雄性不育植物。2.4.7林木發(fā)育有關(guān)基因工程（2）提早開(kāi)花基因林木的幼年期較長(zhǎng)，使育種周期長(zhǎng)。因此，縮短林木世代，促進(jìn)提早開(kāi)花的研究對(duì)林木改良有主動(dòng)作用。目前要緊有如下幾個(gè)基因：LEAFY(LFY)、APETALA1(AP1)、CAULIFLOWER(CAL)、APETALA2(AP2)、UNUSUALFLORALORGANS(UFO)和TERMINALFLOWER(TFL)。LFY是操縱莖向花轉(zhuǎn)變的一個(gè)要緊基因，其強(qiáng)突變體基部花完全轉(zhuǎn)變?yōu)槿~芽，頂部花表現(xiàn)出部分花的特性。轉(zhuǎn)LFY基因的楊樹(shù)過(guò)量表達(dá)LFY基因，大大縮短了從生長(zhǎng)期到成熟期的時(shí)刻。一樣野生型楊樹(shù)需8~20年才能開(kāi)花，而轉(zhuǎn)LFY基因的楊樹(shù)僅5個(gè)月就可開(kāi)花(見(jiàn)下圖)(WeigelandNilsson,1995)。2.4.7林木發(fā)育有關(guān)基因工程（2）提早開(kāi)花基因AP1的功能與LFY部分冗余，其表達(dá)時(shí)期晚于LFY，二者具有加性效應(yīng)，能相互促進(jìn)表達(dá)。組成型表達(dá)擬南芥LFY或AP1基因的柑橘實(shí)生苗童年期縮短，提早開(kāi)花，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的花器官正?？捎?，果實(shí)中有種子。這些性狀可通過(guò)種子傳給后代，實(shí)生苗一年時(shí)刻即可成熟等。從林木中也鑒定和分離了許多LFY、AP1的同源基因，為開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。2.4.8改變花型花色有關(guān)基因工程要緊包括以下幾個(gè)方面：①花色有關(guān)基因；②花型有關(guān)基因；③開(kāi)花調(diào)控有關(guān)基因；④花衰老有關(guān)基因。2.4.8改變花型花色有關(guān)基因工程花色基因花的顏色要緊由類(lèi)黃酮（flavonoids）、類(lèi)胡蘿卜素（carotenoids）和甜菜色素（betalains）三大類(lèi)色素決定?；ㄉ蛴校?（1）pal及4cl基因。PAL（苯丙氨酸脫氫酶），4CL（肉桂酸羥化酶）。-（2）chs基因。CHS（苯基苯乙烯酮合成酶）。-（3）dfr基因。DFR（二氫黃酮醇-4-還原酶）。2.4.8改變花型花色有關(guān)基因工程1996年10月，F(xiàn)lorigene公司首次在澳大利亞出售轉(zhuǎn)基因淡紫色康乃馨；不久，該公司又推出了深紫色康乃馨。加利福尼亞的戴維斯基因工程公司從矮牽牛中分離出一種新的藍(lán)色編碼基因，導(dǎo)入到玫瑰中，獲得了開(kāi)藍(lán)色花的玫瑰，提升了其觀賞價(jià)值。目前，已成功將外源基因轉(zhuǎn)入玫瑰、矮牽牛、康乃馨、郁金香、菊花等多種花卉中，獲得了形形色色的轉(zhuǎn)基因花卉。此外，經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品品質(zhì)改良基因工程、植物修復(fù)(phytoremediation)基因工程2.4.9展望轉(zhuǎn)基因林木研究對(duì)提升林木抗性、抗擊環(huán)境污染、堅(jiān)持生態(tài)平穩(wěn)、提供優(yōu)質(zhì)林產(chǎn)品等各方面將發(fā)揮越來(lái)越重要作用。林木基因工程研究歷史較短，盡管研究涉及到以上多個(gè)方面，但僅在抗蟲(chóng)基因工程等方面取得了重要進(jìn)展，其他方面研究相對(duì)薄弱。與農(nóng)作物相比，不管是目的基因的分離、鑒定和克隆，依舊基因的表達(dá)以及載體構(gòu)建等方面都有待于更廣泛的深入研究。2.4.9展望目前在林木基因工程研究中咨詢題亟待解決:1)林木遺傳轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低,專(zhuān)門(mén)是針葉樹(shù)種,建立轉(zhuǎn)基因體系還比較困難;2)林木樹(shù)體高大,生長(zhǎng)周期專(zhuān)門(mén)長(zhǎng),外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的時(shí)空表達(dá)特性還有待連續(xù)深入研究;3)轉(zhuǎn)基因植株田間開(kāi)釋和安全性咨詢題。因此，林木也具有自身的特點(diǎn),許多樹(shù)種能夠無(wú)性繁育,一旦獲得轉(zhuǎn)基因植株能夠穩(wěn)固地遺傳,而專(zhuān)門(mén)多農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因植株因通過(guò)有性世代可能會(huì)發(fā)生變異或基因丟失。2.4.9展望目前,林木研究的模式植物楊樹(shù)(Populustrichocarpa)全基因組框架圖差不多完成,且楊樹(shù)的功能基因組學(xué)、基因的表達(dá)研究、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)也在相繼開(kāi)展,都為轉(zhuǎn)基因林木的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí),植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到持續(xù)的進(jìn)展和完善,為林木基因工程研究制造了條件。目前，林木基因工程研究迅速進(jìn)展,在林木抗洪澇、耐鹽堿、抗蟲(chóng)、抗病、提升光合效率等基因工程領(lǐng)域內(nèi)將會(huì)取得突破性進(jìn)展。2.5轉(zhuǎn)基因植物的安全性轉(zhuǎn)基因植物的安全性是指轉(zhuǎn)基因植物對(duì)人類(lèi)、動(dòng)植物、微生物和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成的威逼或者潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性的擔(dān)憂可概括為以下兩個(gè)方面：一是轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類(lèi)健康的安全性咨詢題；二是轉(zhuǎn)基因植物對(duì)自然生態(tài)環(huán)境的安全性咨詢題。樹(shù)木是生態(tài)系統(tǒng)的主體，與作物相比，林木樹(shù)體高大，根系發(fā)達(dá)，壽命長(zhǎng)，因此樹(shù)木對(duì)生態(tài)環(huán)境的作用要大得多，轉(zhuǎn)基因樹(shù)木產(chǎn)生的有毒基因產(chǎn)物的累積會(huì)對(duì)周?chē)纳锶缤寥乐械挠幸婕?xì)菌、真菌造成毒害，阻礙林木的生長(zhǎng)發(fā)育甚至造成其死亡。因此，轉(zhuǎn)基因林木的穩(wěn)固性和生態(tài)安全性咨詢題就更加突出。2.5轉(zhuǎn)基因植物的安全性對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭(zhēng)辯，國(guó)際上有幾個(gè)典型的事件:Pusztai事件斑蝶事件加拿大“超級(jí)雜草”事件中國(guó)Bt抗蟲(chóng)棉破壞環(huán)境事件墨西哥玉米事件爭(zhēng)辯的實(shí)質(zhì)：不純粹是科學(xué)咨詢題，而是經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易咨詢題?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性差不多成了國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由于某些媒體的炒作，對(duì)消費(fèi)者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化差不多產(chǎn)生了專(zhuān)門(mén)大的負(fù)面阻礙。2.5.1轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全性關(guān)注要緊集中在：轉(zhuǎn)基因植物開(kāi)釋到田間是否會(huì)發(fā)生外源基因漂流;是否會(huì)破壞自然生態(tài)環(huán)境，打破原有生物種群的動(dòng)態(tài)平穩(wěn);開(kāi)釋到環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)能力、后代更新能力等方面。（1）基因漂流自然生態(tài)條件下，有些栽培植物會(huì)和周?chē)L(zhǎng)的近緣野生種天然雜交，從而將栽培植物中的基因轉(zhuǎn)入野生種中。研究表明，轉(zhuǎn)基因植株可通過(guò)花粉傳播造成一定的外源基因漂流。許多研究證明，在轉(zhuǎn)基因作物開(kāi)釋地外緣一定范疇內(nèi)均可檢測(cè)到一定數(shù)量的花粉，更為極端的事例如轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因玉米造成至少100km外的墨西哥玉米起源中心的基因污染?；蚱鞯娘L(fēng)險(xiǎn)并不是基因漂流本身，而是它可能引起的潛在環(huán)境后果，這取決于基因種類(lèi)、基因的表型性狀及其開(kāi)釋的環(huán)境。評(píng)判外源基因漂流時(shí)，要緊考慮以下幾個(gè)方面：第一，該植物是否是以授粉雜交進(jìn)行繁育，例如大多數(shù)楊樹(shù)栽培品種要緊是以無(wú)性繁育繼代，因此專(zhuān)門(mén)難有基因漂流擴(kuò)散的機(jī)會(huì)。其次，轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)環(huán)境中是否存在近緣野生種，有些樹(shù)種即使在轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)環(huán)境中有近緣野生種存在，也并不一定就會(huì)發(fā)生基因漂流擴(kuò)散現(xiàn)象，因?yàn)樵谧匀粭l件下，二者的可交配性一樣都專(zhuān)門(mén)小。此外，要考慮目的基因種類(lèi)，如果是一個(gè)抗除草劑基因，發(fā)生基因漂流后會(huì)使野生雜草獲得抗性，從而增加雜草操縱的難度。專(zhuān)門(mén)是若多個(gè)抗除草劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)野生種，則會(huì)帶來(lái)災(zāi)難。但若是品質(zhì)有關(guān)基因等轉(zhuǎn)入野生種，可不能增加野生種的生存競(jìng)爭(zhēng)力，因此阻礙也不大。（2）對(duì)生態(tài)平穩(wěn)及多樣性的阻礙昆蟲(chóng)種群具有天生的快速適應(yīng)環(huán)境壓力的能力，使抗蟲(chóng)生物技術(shù)的長(zhǎng)期有效性受到了嚴(yán)峻的威逼。人們擔(dān)憂，在連續(xù)