《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病原菌PCR定性分析》

1DB44/XXXXX—2021實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌PCR定性分析本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌的PCR定性分析方法。本文件適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌核酸定性分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14926實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適合于本文件。3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR體外酶催化合成特異DNA片段的方法，模板DNA先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以四種dNTP為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片段以幾何倍數(shù)擴(kuò)增。3.2實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timePCR，實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)時(shí)熒光PCR方法是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入特異性熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)報(bào)告整個(gè)PCR進(jìn)程，通過讀取每次循環(huán)反應(yīng)中的熒光發(fā)射信號(hào)，間接反映了PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因的量，最后通過擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性或定量分析。3.3Ct值cyclethreshold實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語2DB44/XXXXX—2021下列縮略語適用于本文件。DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）RNA核糖核酸（ribonucleicacid）TAE三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液（tris-acetate-EDTA）5原理用合適的方法提取樣本中的DNA，分別針對(duì)病原菌16sRNA或其他保守的基因設(shè)計(jì)特異的引物探針序列，通過PCR對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果分析該樣品中是否含有某種病原菌。6主要設(shè)備和材料6.1PCR儀。6.2實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.3電泳儀。6.4凝膠成像分析系統(tǒng)。6.5高速冷凍離心機(jī)。6.6普通離心機(jī)。6.7恒溫孵育器。6.8漩渦振蕩器。6.9組織勻漿器。6.10微量核酸定量?jī)x。6.11生物安全柜。6.12PCR超凈工作臺(tái)。6.13冰箱（-20℃)。6.14微量移液器：0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。6.15滅菌離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），滅菌吸頭（10μL，200μL，1mL），滅菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。6.16聚乙烯薄膜袋：90mm×150mm自封袋，使用前紫外滅菌20min。6.17采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。7試劑7.1以下所用的試劑除特別注明者外均為分析純，所用的水為雙蒸水或去離子水，應(yīng)符合GB/T6682所規(guī)定一級(jí)水的要求。所有涉及分子生物學(xué)操作的水均為無DNA酶、無RNA酶水。7.2滅菌PBS。配制方法見附錄A。7.3DNA抽提試劑：基因組DNA提取試劑盒DNeasyBlood&TissueKit或其他類似產(chǎn)品。并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。亦可使用其他7.4無水乙醇。3DB44/XXXXX—20217.5PCR試劑：PremixTaqTM（Version2.0plusdye）、PremixExTaq?（ProbeqPCR）或其他類似產(chǎn)品。注：以上PCR試劑是是由Takara公司提供的商品試劑盒，是本文件適合的市售產(chǎn)品的使用實(shí)例，給出這一信息是為7.6DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：100bp～2000bp。7.750×TAE電泳緩沖液，配制方法見附錄A。7.8溴化乙錠：10mg/mL，配制方法見附錄A，或其他類似產(chǎn)品。7.91.5%瓊脂糖凝膠，配制方法見附錄A。7.10引物和探針：根據(jù)附錄B中表B.1和表B.2的序列合成引物和探針，引物和探針加入無DNA酶、無RNA酶水配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，置于-20℃保存，使用的工作液應(yīng)當(dāng)置于4℃存放，避免引物或探針由于反復(fù)凍融出現(xiàn)降解。8方法8.1生物安全措施對(duì)于可能潛在人獸共患病的樣本，應(yīng)在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，采樣應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。8.2采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套。采樣及樣本處理過程操作人員應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)。8.2.1臟器組織剖檢，無菌采集動(dòng)物臟器，剪取待檢樣本0.5g～2g，加入5倍體積滅菌PBS，使用勻漿器充分勻漿1min～2min，然后將組織懸液在4℃,8000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。8.2.2細(xì)菌培養(yǎng)物參照國(guó)標(biāo)GB/T14926對(duì)臨床樣本進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，獲得可疑陽性培養(yǎng)物，刮取約1mm2～3mm2菌苔，加入500μL無菌水混勻，煮沸后，8000g離心1min，取上清液直接進(jìn)行PCR。8.2.3盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣本0.5g～2.0g，加入5倍體積滅菌PBS，使用勻漿器充分勻漿1min～2min，8000g離心5min，取上清液取離心上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號(hào)備用。8.2.4血液樣本無菌采集動(dòng)物血液0.2mL～0.5mL，加入檸檬酸鈉或EDTA抗凝管中，輕輕顛倒混勻3次～5次，編號(hào)備用。8.2.5拭子取樣4DB44/XXXXX—2021對(duì)活體動(dòng)物取樣可采集肛拭子、咽喉拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子、皮膚拭子等，浸泡于3mL無菌PBS中5min～10min，充分混勻后，4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。8.2.6飼料、墊料和飲水飼料、墊料：取約5g～10g飼料和墊料置于50mL無菌離心管中，加入3倍體積滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5min～10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL無菌離心管，4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號(hào)備用。飲水：取200μL～1000μL實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，編號(hào)備用。8.2.7設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面約5cm2沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入3mL滅菌PBS，浸泡5min～10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號(hào)備用。8.2.8樣本的存放采集或處理的樣本在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置于-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。8.2.9采樣廢棄物處理采樣結(jié)束，動(dòng)物尸體應(yīng)使用生物安全垃圾袋包裝完整，高壓滅菌后交由醫(yī)療垃圾處理單位進(jìn)行處理，采樣器材應(yīng)使用消毒液浸泡或高壓滅菌消毒，并做好實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及采樣室的消毒。8.3核酸提取8.3.1取50μL～100μL的樣本至1.5mL或2mL離心管中，加20μL蛋白酶K，用PBS補(bǔ)加至220μL。8.3.2加入200μL緩沖液AL，渦旋震蕩充分混勻，56℃孵育10min。8.3.3加入200μL的無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。8.3.4移取第8.3.3條制備的混合液至離心柱上，離心柱放在2mL收集管上，≥6000g離心1min。棄收集管/液。8.3.5離心柱放至新的2mL收集管上，加500μL緩沖液AW1，≥6000g離心1min。棄收集管/液。8.3.6離心柱放至新的2mL收集管上，加500μL緩沖液AW2，20000g離心3min。棄收集管/液。8.3.7將離心柱放在一個(gè)新的1.5mL離心管上，吸200μL的緩沖液AE在吸附膜上，室溫孵育1min，≥6000g離心1min。收獲提取DNA液。8.3.8取2μL提取的DNA樣本使用微量核酸定量?jī)x測(cè)定提取DNA濃度。8.3.9制備好的DNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-20℃冰箱保存?zhèn)?.4普通PCR8.4.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，其中陽性對(duì)照以含有陽性病原菌的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以不含有5DB44/XXXXX—2021陽性病原菌的樣本核酸（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來代替模板。表1PCR反應(yīng)體系配制表Forwardprimer（102//注1：可使用其他類似的PCR試劑進(jìn)行，反應(yīng)體系和注2：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比8.4.2PCR反應(yīng)參數(shù)PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。表2PCR反應(yīng)參數(shù)150℃~60℃8.4.3PCR產(chǎn)物電泳分析將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制含核酸染料溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以DNA分子量作參照。電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度來確定，一般控制在3V/cm～5V/cm，當(dāng)上樣染料移動(dòng)到凝膠邊緣時(shí)關(guān)閉電源。電泳完成后在凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄電泳結(jié)果。8.5實(shí)時(shí)熒光PCR8.5.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，其中陽性對(duì)照以含有陽性病原菌的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物提取的核酸作為陽性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以不含有陽性病原菌的樣本核酸（可以是正常動(dòng)物組織或正常細(xì)胞培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來代替模板。6DB44/XXXXX—2021表3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制表ForwardPrimer（10μ/2//8.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表4。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。表4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)否1是9結(jié)果9.1普通PCR9.1.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)在陽性、陰性、空白對(duì)照成立的條件下，即陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析可見到目的擴(kuò)增條帶（條帶大小參見附錄A），陰性對(duì)照及空白對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物無任何條帶，可進(jìn)行結(jié)果判定。9.1.2結(jié)果判定9.1.2.1樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到特定大小的目的擴(kuò)增條帶，判定為該病原菌核酸陽性；9.1.2.2樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上未觀察到特定大小的目的擴(kuò)增條帶，判定為該病原菌核酸陰性。9.2實(shí)時(shí)熒光PCR7DB44/XXXXX—20219.2.1結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取儀器結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。9.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.2.2.1空白對(duì)照無Ct值，并且無熒光擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線為水平線或Ct值小于40。9.2.2.2陰性對(duì)照無Ct值，并且無熒光擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線為水平線或Ct值小于40。9.2.2.3各病原菌陽性對(duì)照Ct值≤35，并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。9.2.3結(jié)果判定9.2.3.1若待檢樣本無熒光擴(kuò)增曲線，則判定該病原菌核酸陰性。9.2.3.2若待檢樣本有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35時(shí)，則判斷該病原菌核酸陽性。9.2.3.3若待檢樣本Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。重新試驗(yàn)后，若Ct值≥40時(shí)，則判定該病原菌核酸陰性。重新試驗(yàn)后的Ct值仍介于35和40之間，則判定該病原菌核酸可疑陽性，需進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定。9.3序列測(cè)定必要時(shí)，可取待檢樣本擴(kuò)增出的陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，序列結(jié)果與已公開發(fā)表的參考菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)，序列同源性在99%以上，可確診待檢樣本某種病原菌核酸陽性，否則判定某種病原菌核酸陰性。10防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的要求執(zhí)行。8DB44/XXXXX—2021（規(guī)范性）溶液的配制A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.1.1A液0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL無離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·H2O）18.61g滅菌去離子水80mL5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0滅菌去離子加至100mL，121℃,15min滅菌備用。A.2.250×TAE電泳緩沖液配制三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0l00mL滅菌去離子加至1000mL，121℃,15min滅菌備用。用時(shí)用滅菌去離子水稀釋至l×使用。A.3溴化乙錠（EB）溶液（10μg/μL）溴化乙錠滅菌去離子水A.4含0.5μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖1×TAE電泳緩沖液20mg20mL加至l00mL9DB44/XXXXX—2021混合后加熱至完仝融化,待冷至50℃~55℃時(shí)，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，輕輕晃動(dòng)搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，將梳子置人電泳槽中，然后將瓊脂糖溶液倒人電泳板上，凝膠適宜厚度為3mm～5mm，需確認(rèn)在梳齒下或梳齒間沒有氣泡，待凝固后取下梳子備用。DB44/XXXXX—2021（規(guī)范性）引物及探針序列針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見病原菌16sRNA或其他保守基因序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR引物序列見表B.1，實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針序列見表B.2。表B.1普通PCR引物（Mycoplasmapulmonis）（Helicobactergenus）（Helicobacterhepaticus）ATGGGTAAGAAAATAGCAAAAAGATTGCCTATTTCATATCCATAAGCTCTTG（Helicobacterbilis）ATGGAACAGATAAAGATTTTAAAGCAACTTC（Helicobacterrodentium）TTGTGAAATGGAGCAAATCTTAA(Helicobactermuridarum)ATGACAAAAAAATATTCTTTCACAAAACTATTCATTGTTTATTTTAGATTCCATTTAACTGCTAAATCATCA（Helicobactertyphlonius）AGGGACTCTTAAATATGCTCCTAGAATTCATCGTGTTTGAATGCGTC（Pasteurellagenus）~pneumotropicaHey1）（PasteurellapneumotropicaJawetz）DB44/XXXXX—2021表B.1普通PCR引物（續(xù)）（Actinobacillusmuris）A.m—F（Streptococcuspneumoniae）（Corynebacteriumbovis）（Salmonellatyphimurium）TCGCACCGTCAAAGGAACCGTGCATTATCGATCAGTACCAGC（Staphylococcusaureus）（Corynebacteriumkutscheri）（Pseudomonasaeruginosa）GACAACGCCCTCAG