常用液相色譜柱原理

常用液相色譜柱使用與保養(yǎng)SOP1.2

液相色譜柱的結(jié)構(gòu)及其主要功能

液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

1.3.2聚合物基質(zhì)柱

聚合物基質(zhì)柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝膠作為主要填料的一類色譜柱。其相對(duì)于硅膠柱具有更強(qiáng)的疏水性及更寬泛的pH范圍（1.0～14.0），但柱效較低，目前主要應(yīng)用于凝膠滲透色譜（GPC）、凝膠過濾色譜（GFC）及分子排阻色譜（MEC）。主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物。1.3.3其他無機(jī)物填料柱

這類色譜柱僅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化鋁（Al2O3）、氧化鋯（ZrO2）等填料。不需要進(jìn)行表面改性，其自身表面即可對(duì)各類化合物有強(qiáng)保留。可在任意pH（氧化鋁除外，不能大于12.0）及高溫度（可達(dá)100℃）下使用。其中，1.3.5常用液相色譜柱主要應(yīng)用范圍與特點(diǎn)匯總1.3.5.1反相色譜柱柱填料類型主要應(yīng)用范圍特點(diǎn)C18（ODS）可分離多種化合物，最適合用于極性樣品或做離子抑制的樣品的分析

普適性好；保留性強(qiáng)，用途廣

；可用于正相。C8（辛基）

與C18相似與C18相似，但保留值稍小C3，C4多用于肽類與蛋白質(zhì)

保留值更小

C1[三甲基單氯硅烷(TMS)]普通反相溶劑分析疏水性強(qiáng)的化合物；使用高水含量溶劑分析高極性化合物

；分離多功能團(tuán)化合物保留值最??；最不穩(wěn)定；可用于反相與正相

苯基，苯乙基

多用于分離分析同時(shí)含極性和非極性芳香化合物的混合物

保留值適中；選擇性有所不同

，對(duì)極性芳香化合物選擇性更強(qiáng)；可用于正相。1.3.5.2正相色譜柱柱填料類型主要應(yīng)用范圍特點(diǎn)CN（氰基）

適用于在ODS上無保留或分離時(shí)間太長的組分的分離，以及樣品中同時(shí)含有親水與疏水性化合物而在ODS上色譜優(yōu)化困難的場合，也可用于氨基酸分析。屬中等級(jí)性柱，普適性好；保留適中，可用于正相與反相。

NH2（氨基）

主要用于分析單糖類、烴類化合物保留性弱；極性大，不穩(wěn)定，酸性條件下易水解；亦可用于反相。OH（二醇基，DIOL）

多用于有機(jī)酸、肽類與蛋白質(zhì)分析

極性大于CN，小于NH2，常做HILIC用?？煞聪嘤?。高純硅膠柱多用于制備LC，適用于多種化合物普適性好；價(jià)廉；操作不太方便；pH窄（2-7.5）；次級(jí)保留效應(yīng)強(qiáng)（硅羥基），易峰拖尾或前延，分叉等。1.3.5.3聚合物基質(zhì)柱（eg.聚苯乙烯柱）

單獨(dú)的聚苯乙烯類填料柱主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若與離子交換基團(tuán)共鍵則形成離子交換柱，用于分離酸性化合物（磺酸基團(tuán)）、堿性合物（季銨基團(tuán)）及藥物代謝產(chǎn)物等。特點(diǎn)：在1＜PH＜13的流動(dòng)相中穩(wěn)定；分離峰形較好，柱子壽命較長。1.3.5.4其他無機(jī)物填料柱

如氧化鋁、石墨化碳、氧化鋯、硅藻土等，主要作制備色譜用。

柱填料類型主要應(yīng)用范圍特點(diǎn)Chiral（手性柱）

常用于分離手性異構(gòu)體，根據(jù)分離不同機(jī)理選擇。不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體需采用不同類型的手性柱

。部分亦可用于反相。HILIC（親水作用柱）最常用Diol柱、丙基酰胺基鍵合硅膠柱，多用于分析極性化合物、端基異構(gòu)體、如藥物極性代謝產(chǎn)物、多肽、有機(jī)酸、糖類等。多用于ELSD檢測，C18無保留化合物，毒品檢查等?？捎糜诜聪?。1.4液相色譜柱制備工藝簡述

不同品牌色譜柱制備工藝各異，但都可歸納為如下流程（以硅膠柱為例）：硅烷化硅膠制備（四乙氧基硅烷脫乙基與聚合）→Si-OH基暴露（

脫乙基，置換成H）→海綿狀多孔硅膠構(gòu)造（物理勻質(zhì)過程）→官能團(tuán)鍵合（各種官能團(tuán)與Si-OH鍵合）→端基封口（對(duì)殘余的Si-OH用小分子的氯-甲基、氯-乙基鍵合

）→潤濕混合（加乙醇等調(diào)勻，其配方各廠家均有專利保護(hù)）→裝填（機(jī)械裝填或手工裝填，層層裝填，壓緊，潤濕）→高壓平衡（軸向加壓或徑向加壓，各廠家均有專利保護(hù)）→干燥（此步為關(guān)鍵工藝步驟，各廠家均有專利保護(hù)）→削平→組件安裝→預(yù)平衡→柱效測試流動(dòng)相平衡→柱效測試→封口→包裝1.5液相色譜柱分離機(jī)理概述

色譜柱類型分離機(jī)理備注常規(guī)反相柱相似相溶常規(guī)正相柱相似相溶離子交換柱樣品離子與色譜柱離子達(dá)到置換動(dòng)態(tài)平衡要關(guān)注pH條件手性柱（Chiralcolumn）氫鍵作用、偶級(jí)-偶級(jí)作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用、空間作用

一般，AGP、HSA、BSA等以疏水作用、空間作用為主

。親水性色譜柱（HILIC）氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級(jí)效應(yīng)及相似相溶基于NP原理氨基酸分析柱相似相溶基于RP原理2、常用液相色譜柱使用方法與維護(hù)保養(yǎng)

(1)認(rèn)識(shí)色譜柱規(guī)范化使用與保養(yǎng)的必要性：延長色譜柱使用壽命，降低色譜柱使用成本，逐步提高分析人員色譜柱使用與維護(hù)水平，確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和重現(xiàn)性，提升個(gè)人在色譜領(lǐng)域的競爭力。(2)熟悉幾個(gè)概念：

液相色譜柱：指用于液相色譜分離的柱形固定相，由柱管、壓帽/卡套、篩板（濾片）、填料、接頭等組合而成，可用于液相色譜分析與制備。色譜柱再生：指色譜柱在非正常情況下，針對(duì)異常現(xiàn)象及原因采取的一系列修復(fù)補(bǔ)救措施，以提高色譜柱柱效和延長其使用壽命的處理過程。運(yùn)載溶劑（ShippingSolvent）：指色譜柱生產(chǎn)廠商在柱出廠測試合格后飽和于色譜柱內(nèi)的合適溶劑，以利于運(yùn)輸保存，多與保存溶劑相同。保存條件（StorageConditions）：指色譜柱生產(chǎn)廠商根據(jù)不同柱類型及其色譜柱填料的制備、鍵合、裝填、高壓定型、凈化干燥等工藝條件的不同要求而特別制定的色譜柱保存前凈化飽和的處理程序與儲(chǔ)存條件，包括凈化程序、凈化溶劑和保存溶劑、保存溫度。保存溶劑（StorageSolvent）：用于保存色譜柱并指定了溶劑組成與

比例的溶液。(3)對(duì)新柱正確老化處理的必要性認(rèn)識(shí)：新購色譜柱出廠前均采用適合的運(yùn)載溶劑（ShippingSolvent）飽和，密封，由于運(yùn)輸過程周期較長，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新飽和與老化。若老化方法不正確或時(shí)間不夠，極易導(dǎo)致色譜柱在使用較短時(shí)間后即產(chǎn)生分離度下降、峰形變差、峰拖尾等柱效降低的情況。需根據(jù)色譜柱不同類型選擇不同飽和與老化方法。2.1普通C8及C18反相色譜柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）（1）準(zhǔn)備新鮮超純水及色譜級(jí)乙腈或甲醇，沖洗色譜儀器系統(tǒng)，保證儀器系統(tǒng)管路干凈。（新柱老化前，此步?jīng)Q不可忽略）（2）將色譜柱反向連接，不接檢測器。用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗20～30min。（目的是沖洗出柱入口端無機(jī)雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）（3）再將色譜柱正向連接，不接檢測器。用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗20～30min。（目的是沖洗出柱出口端無機(jī)雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）（4）連接檢測器，開啟柱溫達(dá)30℃～40℃，用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗4h以上。（目的是充飽和色譜柱，去除柱內(nèi)空氣）

（5）用水-有機(jī)相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗2h以上[或在120min內(nèi)以水-有機(jī)相（95:5→0:100）梯度變化，以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗]→再用100%有機(jī)溶劑，以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→最后用100%有機(jī)溶劑，以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上。（目的是老化色譜柱）

（6）在平衡前根據(jù)水相-有機(jī)相的比例，首先調(diào)整水-有機(jī)相的比例接近流動(dòng)相水相-有機(jī)相的比例，以1ml/min流速?zèng)_洗30左右（目的是相平衡過渡）。如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽，決不可在柱老化后立即用流動(dòng)相平衡，必需先用90%以上水進(jìn)行預(yù)平衡30min以上，否則，會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)析出結(jié)晶，嚴(yán)重時(shí)會(huì)將新柱永久不可逆地?fù)p壞。（7）然后更換成新制并經(jīng)0.45um濾膜過濾，超聲脫氣后的流動(dòng)

相，按檢測方法平衡至少1h，待基線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣檢測。

（8）由于是新柱首次使用，在進(jìn)樣完成后需立即對(duì)色譜柱進(jìn)行凈化和有機(jī)溶劑飽和。方法是：用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以1ml/min流速?zèng)_洗30min以上（或者采用溶劑梯度變化至100%有機(jī)相沖洗120min以上）→最后用100%有機(jī)溶劑，以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上。若流動(dòng)相中有緩沖鹽，建議用100%水沖洗1h以上后，再重復(fù)上述凈化程序（但個(gè)別品牌C8或C18色譜柱不耐受純水沖洗者例外）。

在新色譜柱使用幾次，均正常后，運(yùn)行完畢凈化處理程序可簡化為：用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用100%有機(jī)溶劑，以1ml/min流速?zèng)_洗30min以上→選擇柱說明書中保存條件（StorageConditions）規(guī)定的保存溶劑（StorageSolvent）沖洗10倍柱體積以上→封口，保存。

（9）凈化完畢，若次日不再使用，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。（10）備注：老化用有機(jī)溶劑推薦使用色譜級(jí)甲醇，不同品牌色譜柱需區(qū)別對(duì)待；水需用去離子的超純水。若色譜柱使用后入庫保存，長時(shí)間未使用，重新使用時(shí)仍需重新飽和。方法是：用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用100%有機(jī)溶劑，以1ml/min流速?zèng)_洗30min以上→然后調(diào)整水-有機(jī)相的比例接近流動(dòng)相水相-有機(jī)相的比例，以1ml/min流速?zèng)_洗30左右→最后用流動(dòng)相平衡1h以上，進(jìn)樣檢測。必需注意流動(dòng)相pH值不能超過色譜柱pH耐受范圍，過酸容易使鍵合相變態(tài)，過堿則易導(dǎo)致硅膠溶解柱床塌陷。（11）特別提示：當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進(jìn)樣后，由于表面活性劑會(huì)在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時(shí)，處理方法如下：將色譜柱反向連接接，不接檢測器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速?zèng)_洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上，即可恢復(fù)。（12）警告：無論何時(shí)，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進(jìn)樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動(dòng)相長時(shí)間（30min以上）走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開裂。使用與保存時(shí)，嚴(yán)禁用力甩，絕對(duì)杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導(dǎo)致柱床機(jī)械性損壞，則再無再生可能。2.2正相色譜柱（Normal–PhaseChromatographycolumn）

目前，正相色譜分析最常用的是氨基柱與氰基柱。2.2.1氨基柱（-NH2）

氨基柱可以同時(shí)用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時(shí)需注意，正相反相交替使用時(shí)必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動(dòng)相互溶。新購氨基柱老化處理及使用基本程序如下：1）若需要在正相條件下使用：①用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速?zèng)_洗約50倍柱體積[備注：氨基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑，eg.正己烷-乙腈（99：1）]。

②再根據(jù)待分析用正相流動(dòng)相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速?zèng)_洗約10倍柱體積。③用正相流動(dòng)相平衡1h以上，確保柱壓控制在6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣檢測。如果要使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，在使用流動(dòng)相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。④分析完畢，用異丙醇，以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約30倍柱體積→再用甲醇，以1ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約10倍柱體積。若使用的分析用流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相沖洗約30倍柱體積，再按上述方法沖洗。⑤再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以1ml/min沖洗約10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷-乙腈（99：1）。⑥重新在正相條件下使用時(shí)，重復(fù)上述①～⑤過程即可，時(shí)間可適當(dāng)減少一半左右。2）若需要在反相條件下使用：①先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速?zèng)_洗約30倍柱體積→再依次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿→異丙醇→甲醇→甲醇-水（50：50）分別沖洗柱子約10倍柱體積→再以0.5ml/min的流速，用pH11.0以下的氫氧化鈉溶液沖洗柱子約30倍柱體積（注意：pH值切不可超過11.0）→立即用水以0.5ml/min的流速?zèng)_洗柱子約30倍柱體積→最后換成反相流動(dòng)相平衡1h以上，待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測。（備注：若要使用的反相流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，在用反相流動(dòng)相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時(shí)，要特別注意控制pH值范圍及流動(dòng)相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動(dòng)相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最理想的pH范圍在pH3.0-7.0，決不允許超過11.0。）②反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱,但需注意，沖洗溶劑中有機(jī)相不能低于10%；凈化完畢，先用甲醇以0.5ml/min的流速?zèng)_洗柱子約10倍柱體積→然后用異丙醇以0.5ml/min的流速?zèng)_洗柱子約10倍柱體積→最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑[一般用正己烷-乙腈（99：1）]以1ml/min沖洗約10倍柱體積→密封，保存即可。2.2.2氰基柱（-CN）

氰基柱可以同時(shí)用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時(shí)需注意，正相反相交替使用時(shí)必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動(dòng)相互溶。新購氰基柱老化處理及使用基本程序與氨基柱基本相同，主要程序如下：1）若需要在正相條件下使用：①用異丙醇或正己烷以0.5ml/min的流速?zèng)_洗約30倍柱體積。（備注：氰基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑，eg.正己烷或異丙醇。）②再根據(jù)待分析用正相流動(dòng)相極性選用極性相近的氯仿、異丙醇或二氯甲烷以相同的流速?zèng)_洗約10倍柱體積。③用正相流動(dòng)相平衡1h以上，確保柱壓控制在6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣檢測。如果要使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，在使用流動(dòng)相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。④分析完畢，用異丙醇，以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約30倍柱體積→再用甲醇，以1ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約10倍柱體積。若使用的分析用流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相沖洗約30倍柱體積，再按上述方法沖洗。⑤再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以0.5ml/min沖洗約10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷或異丙醇。⑥重新在正相條件下使用時(shí)，重復(fù)上述①～⑤過程即可，時(shí)間可適當(dāng)減少一半左右。2）若需要在反相條件下使用：操作和維護(hù)與C18柱基本相同，但需注意，沖洗溶劑中有機(jī)相不能低于10%。①新柱先用正己烷或異丙醇以0.5ml/min的流速?zèng)_洗約30倍柱體積→再依次以0.5ml/min的流速，用等量的水-乙腈（95:5）→THF（四氫呋喃）→水-乙腈（5:95）分別沖洗柱子約10倍柱體積[最好再繼續(xù)用水-乙腈（5:95）以0.2-0.3mL/min過夜沖洗]→最后換成反相流動(dòng)相平衡1h以上，待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測。（備注：若要使用的反相流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，在用反相流動(dòng)相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時(shí)，要特別注意控制pH值范圍及流動(dòng)相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動(dòng)相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最理想的pH范圍在pH1.5-7.0。）②反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱；凈化完畢，先用甲醇以0.5ml/min的流速?zèng)_洗柱子約10倍柱體積→然后用異丙醇以0.5ml/min的流速?zèng)_洗柱子約10倍柱體積→最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑（一般用正己烷或異丙醇）以0.5ml/min沖洗約10倍柱體積→密封，保存即可。2.3陰/陽離子交換色譜柱（negion/cationexchangecolumn）

陰/陽離子交換柱屬于強(qiáng)離子交換柱，分為玻璃柱與不銹鋼柱，多用不銹鋼柱。陽離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強(qiáng)陽離子基團(tuán)，含有磺酸鹽功能團(tuán)，屬于酸性離子柱，特別設(shè)計(jì)用于常規(guī)HPLC分析有機(jī)和無機(jī)陽離子。陰離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強(qiáng)陰離子基團(tuán)，含有季胺堿功能團(tuán)，屬于堿性離子柱，特別設(shè)計(jì)用于常規(guī)HPLC分析有機(jī)和無機(jī)陰離子。對(duì)于新柱而言，二者老化、使用與保養(yǎng)程序類似，主要方法如下：（1）首先在開始使用系統(tǒng)以前檢查柱子有否微生物生長，否則柱子會(huì)堵塞，柱壓會(huì)升高到無法接受的水平。然后，不接檢測器，正向安裝色譜柱，使用純甲醇以0.6ml/min流速?zèng)_洗約5倍柱體積。（2）再連接檢測器，用純甲醇以0.6ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積。（3）然后使用去離子水以0.6ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積。（4）最好再確保連接好保護(hù)柱（多使用相應(yīng)柱制造商針對(duì)性提供

的保護(hù)柱），再用選用的洗脫液以0.6ml/min流速平衡1h以上，進(jìn)樣檢測。同樣，若洗脫液中含有緩沖鹽類，在用分析洗脫液平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例洗脫液過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。

（5）特別提示：

①洗脫液要求是新制的低電導(dǎo)率緩沖液，或者是有UV吸收的緩沖液。對(duì)于陽離子交換柱，多用檸檬酸或酒石酸緩沖液（或其混合溶液）、鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5；對(duì)于陰離子交換柱，多用磷酸緩沖液、硝酸銨溶液（1mMol/L），鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5。絕對(duì)禁止使用水楊酸緩沖液，因水楊酸分解產(chǎn)物會(huì)改變固定相的性質(zhì)。洗脫液在使用以前必須用0.45微米濾膜過濾并徹底脫氣，以防止發(fā)生檢測和泵送問題。

②提倡在室溫環(huán)境使用，為了提高分析的穩(wěn)定性，可以設(shè)置高于室溫5～10℃的柱溫，最好不要在40℃以上使用。2023/12/30梅特勒上海公司維修部22③使用過程中不要超過其耐受最高壓力（不銹鋼柱：4500psi；玻璃柱：3000psi）。④增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止柱床的擾動(dòng)。更換柱子，必須先降低流量至0，等待洗脫液完全流出柱子，壓力變化到0（約2分鐘）后再更換。⑤必須防止將來自流動(dòng)相或者樣品中的疏水性或與流動(dòng)相極性差別很大的化合物進(jìn)入色譜柱，特別地，要絕對(duì)禁止導(dǎo)入顆粒雜質(zhì)，以防止操作壓力增高，污染物難以或者不能去除。（6）分析完畢，凈化程序基本同C18柱，先用去離子水以0.6ml/min流速?zèng)_洗約20倍柱體積→然后用甲醇以0.6ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積，純甲醇飽和后→密封保存即可。（注意：一定要確保在柱子內(nèi)沒有緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下保存色譜柱。）（7）長時(shí)間保存后重新使用，重復(fù)上述（1）～（6）即可。2023/12/30梅特勒上海公司維修部23（8）使用并正確處理完畢，入庫保存于防塵環(huán)境下，登記備案。（9）特別說明：部分離子交換柱的使用條件、保存溶劑與保存條件、預(yù)平衡溶劑與方法、再生方法等有特殊要求。[eg.phenomenex

RezexROA-OrganicAcidH+(酸性陽離子柱)]①柱壓必須控制在600psi之內(nèi)；流動(dòng)相中有機(jī)相比例不得超過10%，流速應(yīng)小間隔上升至0.6ml/min，且不得超過0.6ml/min，降低流速亦然；柱子用超純水飽和后保存于4℃左右冰箱中；運(yùn)行時(shí)，柱溫不超過85℃。②分析完畢，用超純水清洗30倍柱體積以上，密封保存。③為防止色譜柱長時(shí)間保存時(shí)長菌，應(yīng)使用0.05mol/L左右的硫酸溶液（陽離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）飽和后保存于4℃左右冰箱中。新柱或舊柱再次使用前均需先用去離子水，以0.6mL/min流速?zèng)_洗色譜柱約30倍柱體積，將柱內(nèi)硫酸或氨水徹底洗出→然后用流動(dòng)相平衡，進(jìn)樣檢測即可。分析完畢，先用去離子水，以0.6ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約30倍柱體積→再用0.5mol/L左右的0.05mol/L左右的硫酸溶液（陽離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）沖洗色譜柱約10倍柱體積→密封，保存即可。具體流速需根據(jù)柱長與柱內(nèi)徑選擇，一般不允許超過0.6ml/min，因流速過大易導(dǎo)致鍵合相隨流動(dòng)相流出。其他具體要求，請仔細(xì)閱讀相關(guān)說明書，并以說明書為準(zhǔn)。2.4手性色譜柱（ChiralHPLCColumn）

手性色譜柱（ChiralHPLCColumn）是由具有光學(xué)活性的單體，鍵合在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（ChiralStationaryPhase）。通過引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體分離的目的。主要有刷（Brush）型或稱為Prikle型、纖維素（Cellulose）型、環(huán)糊精（Cyclodextrin）型、大環(huán)抗生素（Macrocyclicantibiotics）型、蛋白質(zhì)（Protein）型、配位交換（Ligandexchange）型、冠醚（Crownethers）型等類型，此類色譜柱可用于正相系統(tǒng)與反相系統(tǒng)，多用于正相系統(tǒng)。

常用的是蛋白質(zhì)（Protein）型，其分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用，大多可用于反相色譜條件。目前使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-AcidGlycoprotein，AGP）、人血清白蛋白（HumanSerumAlbumin，HSA）、牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。2023/12/3025避免過度超載

由于手性柱一般都較為昂貴，使用不當(dāng)又極易導(dǎo)致?lián)p壞，且再生尤其困難，所以使用、維護(hù)與保養(yǎng)均需特別慎重

。對(duì)于新的手性柱，使用、老化與保養(yǎng)程序基本類似，但由于制造商工藝條件各異，需要根據(jù)不同基質(zhì)特點(diǎn)分析，參照并嚴(yán)格按照相應(yīng)說明書進(jìn)行處理。一般（以AGP柱為例）主要程序如下：（1）將色譜柱接到色譜儀器之前，必須先用合適的溶劑沖洗流路（包括六通閥和定量環(huán)）。絕對(duì)杜絕流路中殘存丙酮、氯仿、DMF（二甲基甲酰胺）、DMSO（二甲基亞砜）、乙酸乙酯、二氯甲烷、THF（四氫呋喃）等，以防止破壞手性固定相。如果在進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣間隔的洗針液必須更換成合適的溶劑，最好是15%～20%的異丙醇溶液。然后連接好色譜柱，不接檢測器，用純水以0.5ml/min流速?zèng)_洗約20min。（注意：流速需小間隔從0升至0.5ml/min）（2）連接檢測器，再用純水以0.5ml/min流速?zèng)_洗約120min。（3）用15%以內(nèi)的異丙醇溶液以0.5ml/min流速?zèng)_洗約60min。（4）再用純水以0.5ml/min流速?zèng)_洗約60min。（5）用流動(dòng)相以不超過0.8ml/min流速平衡約1h直至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測。（6）分析完畢，用純水以0.5ml/min流速?zèng)_洗約60min，以徹底洗出緩沖鹽，然后用15%以內(nèi)的異丙醇溶液以0.5ml/min流速?zèng)_洗約30min，密封，保存于10℃左右環(huán)境中，登記備案。（7）特別注意：①必須確保柱壓在50bar～100bar之間，一定不要超過100bar。流速一般不大于0.8ml/min，具體應(yīng)以不超過色譜柱使用壓力上限為準(zhǔn)。升高或降低流速均需以小間隔逐步升高或降低。②提倡在室溫下使用，但一般要求柱溫不超過25℃。③要特別注意流動(dòng)相及樣品溶解溶液的pH值，最佳pH范圍為4.0～7.0，切不可超過10.0，以防止硅膠溶解而損壞填料，所以pH最好不要超過8.0。否則，極易導(dǎo)致手性分離不佳、色譜峰嚴(yán)重變寬、色譜峰拖尾及分叉等。強(qiáng)堿性溶液的導(dǎo)入，尤其容易導(dǎo)致手性柱不可逆損壞，無再生可能而徹底報(bào)廢！④以上（1）～（6）是在反相條件下使用情況，如果要換成正相使用，必需先用100%異丙醇以0.5ml/min流速?zèng)_洗約30min過渡，其他要求同上。⑤色譜柱保存時(shí)，必需保證柱內(nèi)無緩沖鹽或其他鹽類物質(zhì)殘存。⑥手性柱在使用過多次且正常后，可簡化上述程序，將時(shí)間適當(dāng)縮短即可。（8）特別建議：①當(dāng)分離分析酸堿性手性化合物時(shí)，有必要在流動(dòng)相加入少量電荷遷移添加劑（濃度不超過10mMol/L）來提高手性柱的手性選擇性。常見的有：分離酸性化合物時(shí)，添加酸性添加劑[如三氟乙酸(TFA)、乙酸(Aceticacid)、甲酸(Methanoicacid)、七氟乙酸（HFBA）、辛酸（OA）]，濃度0.01%～0.5%；分離堿性化合物時(shí)，添加堿性添加劑[如二乙胺(DAE)、三乙胺（TAE）、丁胺(Butylamine，BAE)、乙醇胺(Ethanolamine，EthAE)、N，N-二甲胺（DMOA）]，濃度0.01%～0.5%。②辛酸（OA）及N，N-二甲胺（DMOA）與水的互溶性有限，在常溫下，僅僅2mMol/L（OA）或5mMol/L（DMOA）能均一的溶解于水中，若超此限度，將分層。因此，需特別注意兩者水溶液的濃度。③由于上述電荷遷移添加劑與手性柱柱床有很好的親和力，難以從柱上洗除，長期使用可能會(huì)導(dǎo)致柱性能下降。因此，建議添加上述電荷遷移添加劑使用后的手性柱應(yīng)作為某一品種分析專用柱。（9）特別說明：①部分手性柱（以AGP柱為例）使用前要求用10mMol/L的醋酸銨緩沖液（AmmoniumacetrateBuffer，冰醋酸調(diào)pH至5.8）-異丙醇（2-PrOH）（95:5）進(jìn)行預(yù)平衡。操作程序基本同上，不同在于：需先用純化水以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱30倍柱體積以上→再用10mMol/L的醋酸銨緩沖液（AmmoniumacetrateBuffer，冰醋酸調(diào)pH至5.8）-異丙醇（2-PrOH）（95:5）以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱30倍柱體積以上→然后用純化水以0.5ml/min流速?zèng)_洗色譜柱10倍柱體積以上→最后用流動(dòng)相平衡1h以上，進(jìn)樣檢測即可。分析完畢，凈化保養(yǎng)程序同上（1）～（6）。②部分HSA及BSA手性柱，使用保養(yǎng)程序較為簡易。即先用水-有機(jī)相（95:5或100:0），小間隔升高流速至0.5或1ml/min，沖洗約30倍柱體積→再用流動(dòng)相平衡1h左右，進(jìn)樣檢測即可。分析完畢，用水-有機(jī)相（95:5或100:0），小間隔升高流速至0.5或1ml/min，沖洗約30倍柱體積→然后用100%有機(jī)溶劑（一般多用乙腈）同流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再以小間隔將流速降至0→密封，保存即可。③也有部分品牌手性柱（eg.YMCCHIRALNEV手性柱）用純乙腈保存，通常在反相條件下使用。使用前，應(yīng)用純水小間隔升高流速至0.5ml/min，沖洗約60min或老化4h或更久→再更換成流動(dòng)相小間隔升高流速至所需流速平衡至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測即可。分析完畢，亦用純水以0.5ml/min流速?zèng)_洗約60min→再用乙腈沖洗約30倍柱體積，密封保存即可。柱溫要求30～45℃。柱壓（扣除系統(tǒng)背景壓力）有特殊要求，一般，150mm柱不得高于20MPa（3000Psi）；250mm柱不得高于25MPa（3700Psi）。流動(dòng)相pH范圍為2.0～6.5。2.5親水性色譜柱（Hydrophilicchromatographiccolumn，HILIC）親水性色譜是正相色譜的一個(gè)變種。

HILICHPLCColumn親水性色譜柱是以超純硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有二氧化硅(silica，弱酸性)，氰基（cyano，弱酸性）,

二羥基（diol，中性），二丙基乙酰胺基（valpromide，弱堿性），丙基酰胺基（Venusil，弱堿性），氨基（amino，弱堿性）,

吡啶基（Pyridine，弱堿性），咪唑基（Imidazole，弱堿性）等親水基團(tuán)的極性固定相?？捎糜谡?、反相和親水液相色譜，是代替氨基柱和硅膠柱的最佳選擇。與傳統(tǒng)硅膠柱相比，具有更好的重現(xiàn)性和柱壽命。HILICHPLCColumn親水性色譜柱適合于分離在反相色譜柱上不保留的極性化合物，尤其是對(duì)強(qiáng)極性堿性化合物的保留能力強(qiáng)，因此，其成為研究藥物代謝、藥物發(fā)現(xiàn)和組合化學(xué)科學(xué)的首選，尤其適用于LC-MS及LC-ELSD。通常主要用于分離水溶性極強(qiáng)的極性化合物，如有機(jī)酸（eg.水楊酸）、糖類等。其檢測靈敏度可比使用反相色譜柱提高10～1000倍。其使用與保養(yǎng)基本同正相色譜柱，主要程序及注意事項(xiàng)如下：（1）新柱老化時(shí)，應(yīng)采用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積進(jìn)行一次預(yù)平衡→再用水-乙腈（30:70）以檢測條件流速，沖洗約10倍柱體積進(jìn)行二次預(yù)平衡。（2）再用初始流動(dòng)相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進(jìn)行初始平衡。（3）然后進(jìn)樣1至2針，進(jìn)行進(jìn)樣平衡。（4）再用初始流動(dòng)相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進(jìn)行最終平衡。（5）進(jìn)樣檢測。（6）分析完畢，凈化處理程序如下：首先用水-乙腈(90:10)以0.4～0.8ml/min流速，沖洗約30倍柱體積（洗出強(qiáng)極性物質(zhì)）→再用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積（洗出中等極性物質(zhì)）→再用水-乙腈（10:90）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少30倍柱體積（洗出弱極性物質(zhì)及飽和色譜柱）→密封，保存即可（保存溶劑多為90%乙腈溶液，多保存于10℃左右環(huán)境中）。

3、液相色譜柱常見問題分析與解決方案

這部分內(nèi)容為長期實(shí)踐積累，重點(diǎn)關(guān)注色譜柱使用中經(jīng)常遇到的問題，并針對(duì)這些問題進(jìn)行適當(dāng)處理，以延長柱壽命。這些解決辦法也不能保證百分之百有效，但一般情況下，可以嘗試，往往能得到意外的驚喜?，F(xiàn)根據(jù)常用液相色譜柱的常見問題分類別詳述如下：3.1普通C8及C18反相色譜柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）

當(dāng)色譜柱使用較長時(shí)間之后，就可能發(fā)生柱壓升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況，這時(shí)就需要根據(jù)故障原因?qū)ιV柱進(jìn)行清堵與再生，以延長色譜柱的使用壽命。具體原因及處理方法如下：（1）篩板堵塞與柱頭塌陷：主要現(xiàn)象有柱壓嚴(yán)重升高或不穩(wěn)定、色譜峰拖尾、色譜峰變寬、色譜峰分叉、禿峰等，需要進(jìn)行清堵與彈性復(fù)原處理。（此方法適合于任何類型有相同故障的色譜柱的處理，不同的是溶劑要與相應(yīng)類型色譜柱匹配。）主要處理方法如下：①一般情況下，將色譜柱反接，不接檢測器，用純水或水-有機(jī)相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速?zèng)_洗約4h→再正向連接，接或不接檢測器，用純水或水-有機(jī)相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速?zèng)_洗約1h→再提高流速至1.0ml/min沖洗1h，觀察柱壓變化。若不湊效，則擰開柱頭螺母（色譜柱進(jìn)口），小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20min左右，再用純水超聲20min左右。用小勺清理掉柱進(jìn)口污染的部分填料，再將用乙醇調(diào)和后的相應(yīng)的硅膠裝入柱入口（也可用已經(jīng)報(bào)廢的同類柱中的填料替代），用平面不銹鋼小鏟壓緊填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否則，壓得太緊柱壓會(huì)升高，然后裝上清洗過的篩板，注意篩板安裝方向必需與原裝相同，最后緊固。②沖洗與飽和：清堵緊固后，先反向連接色譜柱，不接檢測器，用純水或水-有機(jī)相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速?zèng)_洗約4h→再換成甲醇以0.5ml/min流速?zèng)_洗約2h→再正向連接色譜柱，接或不接檢測器，用純水或水-有機(jī)相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速?zèng)_洗約2h→再換成甲醇以0.5ml/min流速?zèng)_洗約1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速?zèng)_洗約1h以上，再根據(jù)測試用流動(dòng)相比例調(diào)整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速?zèng)_洗約1h，最后用測試用流動(dòng)相平衡2h，進(jìn)樣測試即可。③特別說明：如不是特殊情況，按其他辦法可行，則最好不要反沖色譜柱和拆卸篩板。（2）柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓基本正常，但出現(xiàn)拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分離度降低等。需要進(jìn)行再生處理，具體方法如下：①一般情況下，順接色譜柱，按如下溶劑順序及條件沖洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）→75％乙晴-25％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上，根據(jù)實(shí)際情況可忽略）→100%異丙醇（0.5ml/min，20倍柱體積以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱體積以上）→檢測用流動(dòng)相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣測試。在沖洗過程中，隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，確保不超過4000psi；若超出，可通過降低流速，升高柱溫來調(diào)整，具體操作可咨詢具備相關(guān)專業(yè)知識(shí)背景和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的人士。②若上述方法效果不理想，可按如上溶劑順序和條件，先反接色譜柱沖洗→再順接色譜柱，用100%乙腈以1ml/min流速?zèng)_洗約2h→再用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1ml/min流速?zèng)_洗約30min→最后用流動(dòng)相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣測試即可。③特別說明：再生過程必須隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，柱壓過高易導(dǎo)致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時(shí)要保證再生時(shí)間足夠。（3）當(dāng)分析復(fù)雜樣品時(shí)間過長，尤其是中藥分析，若出現(xiàn)柱壓正常而色譜峰形變差，分離度降低時(shí)可嘗試如下方法再生：先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，將色譜柱反向連接，以1ml/min沖洗60分鐘以上→再用四氫呋喃（或丙酮）以0.5ml/min沖洗60分鐘以上（去除脂類）→再用65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min沖洗60分鐘→然后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘→接著用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1ml/min流速?zèng)_洗約30min→最后用流動(dòng)相平衡2h，進(jìn)樣測試即可。（4）特別提醒：再生時(shí)最好選擇不具備在線脫氣的獨(dú)立泵送系統(tǒng)色譜儀器進(jìn)行，以防正相溶劑損壞脫氣機(jī)密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。3.2正相色譜柱（Normal–PhaseChromatographycolumn）3.2.1氨基柱（-NH2）①在正相條件下使用時(shí)，故障率較低。但要注意不可進(jìn)樣含有醛基、羰基的化合物，不可用于還原糖的分析；流動(dòng)相要徹底脫氣，并不得含有羰基化合物和過氧化物（質(zhì)量較差的乙醚、四氫呋喃等溶劑中含有少量）。任何時(shí)候更換流動(dòng)相時(shí)都要確保新流動(dòng)相與柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用異丙醇過渡。

當(dāng)使用氨基柱進(jìn)行酸性物質(zhì)分析時(shí)，酸性物質(zhì)溶液有質(zhì)子存在，會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后被測成分保留性質(zhì)有所改變或柱效下降。這時(shí)，建議按如下方法處理：

首先用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→然后用甲醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約10倍柱體積過渡，回到平常使用的正相流動(dòng)相平衡2h，進(jìn)樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試按以下程序沖洗與再生：

首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速?zèng)_洗該柱約5～10倍柱體積→然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速?zèng)_洗該柱約5～10倍柱體積以洗去多余NH3→再用添加少許NH3（如0.1％）的酸性分析物的流動(dòng)相平衡2h左右，進(jìn)樣檢測即可。②在反相條件下使用時(shí)，-NH2鍵會(huì)水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會(huì)下降很快，所以故障率較高。若出現(xiàn)柱壓增高柱效降低等情況，建議采用如下方法處理：

若流動(dòng)相含有緩沖鹽，先以流動(dòng)相比例的水-有機(jī)溶劑，以檢測分析時(shí)同流速?zèng)_洗約30倍柱體積→再用純甲醇，以1.0ml/min流速?zèng)_洗約50倍柱體積→然后用異丙醇，以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積過渡→再用二氯甲烷以0.6ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積過渡回到甲醇條件下，以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積，密封保存或用流動(dòng)相平衡2h左右（若流動(dòng)相含有緩沖鹽，需先用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗約30min），進(jìn)樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：

95％水-5％乙腈，以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→THF（四氫呋喃），以0.6ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→95％乙腈-5％水以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→保持95％乙腈-5％水，以低流速0.2-0.5mL/min沖洗過夜→流動(dòng)相平衡2h（若流動(dòng)相含有緩沖鹽，需先用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗約30min），進(jìn)樣檢測即可。3.2.2氰基柱（-CN）

①在正相條件下使用時(shí)，故障率較低，操作和維護(hù)與氨基柱基本完全相同。但當(dāng)柱子使用一定時(shí)間后，若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復(fù)其柱性能。具體方法如下：

用氯仿以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→然后用二氯甲烷以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用流動(dòng)相（pH1.5-7.0為佳）平衡1h，待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測即可。②在反相條件下使用時(shí)，-CN鍵會(huì)水解，尤其是在pH1.5-7.0范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會(huì)下降很快，所以故障率較高。如果在這個(gè)條件下使用，一定要注意及時(shí)清洗。若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復(fù)其柱性能。具體方法如下：

若流動(dòng)相含有緩沖鹽，先以流動(dòng)相比例的水-有機(jī)溶劑，以檢測時(shí)同流速?zèng)_洗約30倍柱體積→再用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用THF（四氫呋喃）以0.6ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用流動(dòng)相平衡2h（若流動(dòng)相含有緩沖鹽，需先用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗約30min），進(jìn)樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：

用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用THF（四氫呋喃）以0.5ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速?zèng)_洗約10倍柱體積→保持95%乙腈-5%水繼續(xù)沖洗，以低流速0.2～0.5mL/min沖洗過夜→流動(dòng)相平衡2h（若流動(dòng)相含有緩沖鹽，需先用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1.0ml/min流速?zèng)_洗約30min），進(jìn)樣檢測即可。3.3陰/陽離子交換柱（negion/cationexchangecolumn）

3.3.1陽離子交換柱常見故障與處理：離子交換柱屬于較脆弱的色譜柱，陽離子交換柱在使用過程中，往往會(huì)由于不規(guī)范操作而導(dǎo)致一系列故障。常見故障如下：①柱壓升高伴隨柱效降低：主要是由于系統(tǒng)管路或柱保存過程中柱內(nèi)或長菌、樣品溶液中的顆粒物積聚在燒結(jié)物或者柱床上等所致。②色譜