【可降解塑料分析進(jìn)展綜述報(bào)告8300字（論文）】

可降解塑料研究進(jìn)展綜述報(bào)告目錄15911前言 196412生物可降解材料的概述 175232.1生物降解技術(shù)機(jī)理 1156682.2合成高分子材料 2279562.3聚氨酯材料的改性研究 23902.4生物可降解材料的應(yīng)用 280782PET的生物降解 373432.1PET水解酶的概述 399972.2PET水解酶的研究進(jìn)展 4113662.3PET水解產(chǎn)物的分析方法 8291662.3.1高效液相色譜（HPLC）分析 860902.3.2對(duì)苯二甲酸（TPA）熒光檢測(cè) 874992.3.3紫外分光光度法 9225882.4PET水解酶的活性測(cè)定方法 9294392.4.1對(duì)硝基苯酚法 9302382.4.2快速比色法 940872.4.3快速比濁法 10165063PET降解工藝 10158013.1酶的純化方式 10160873.2反應(yīng)體系的預(yù)處理 1285443.2.1PET納米顆粒的制備 1258343.2.2堿水解預(yù)處理 12131663.2.3表面活性劑預(yù)處理 1211016結(jié)論 1320248參考文獻(xiàn) 141前言由于科技正以光速進(jìn)步著，各種材料種類也開始增多。其中，高分子材料是最有前途的材料之一。它有很多功能，并且可被再次利用，是非常好的工業(yè)材料，所以在行業(yè)中得到了很廣泛的應(yīng)用。不過當(dāng)前發(fā)現(xiàn)了一些新的問題，我國每一年至少有50%-60%的聚合物材料都需要國家撥款才可以進(jìn)行生產(chǎn)，并且可分解率極低，加重了我國環(huán)境的負(fù)擔(dān)。目前，大部分世界國家都在研究一種可降解的高分子材料。因?yàn)樯锝到饧夹g(shù)進(jìn)步飛快，在塑料制品的降解過程中，各種生物降解材料也被廣泛利用，這極大降低了廢塑料產(chǎn)品對(duì)于我國環(huán)境的污染性，也為我國塑料制品的發(fā)展提供了一個(gè)新的發(fā)展方向?，F(xiàn)在可降解塑料在我國的發(fā)展態(tài)勢(shì)良好，并且很多被廣泛用于我國的工業(yè)生產(chǎn)。不過總的來說，可降解塑料的應(yīng)用范圍還需要進(jìn)一步開發(fā)，其性能也待進(jìn)一步的完善?？偟膩碚f，我國的生物降解材料制造技術(shù)還不是很發(fā)達(dá)。聚酯薄膜的生產(chǎn)主要以聚琥珀酸為原料，經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)，最后生成成品，同時(shí)還能提高樹脂材料的各項(xiàng)性能。既滿足了材料的經(jīng)濟(jì)性要求，又符合了可降解要求以及性能要求。2生物可降解材料的概述2.1生物降解技術(shù)機(jī)理當(dāng)前世界上被廣泛研發(fā)的生物可降解材料屬于一種高分子材料，有著極高的延展性，即使被廢棄也能夠在環(huán)境中被自然分解，因此環(huán)保性比較強(qiáng)。這種可降解材料的降解需要經(jīng)歷一系列的化學(xué)反應(yīng)，主要借助于微生物的酶對(duì)可降解材料進(jìn)行降解，使得酶和聚合物進(jìn)行充分反應(yīng)，最后使得聚合物被水解成分子小片段。打破聚合物的大分子骨架。接著再將這些小片段再次分解為小分子，整個(gè)降解過程就完成了。一般的高分子可降解材料的降解需要光照以及微生物進(jìn)行降解，生物降解的方法大致有三種：（1）生物物理學(xué)：隨著生物細(xì)胞的不斷成熟，材料在分解過程中，使得電離質(zhì)量降低，并產(chǎn)生了一些低聚物；（2）生化作用：微生物具有聚乳酸生成能力，酶促微生物使得一些材料被直接降解。光生物降解機(jī)制使得淀粉等有機(jī)物直接背光進(jìn)行降解。另外，光敏劑會(huì)受到各種外在條件的反應(yīng)催化生成聚合物，使得其成為了能被微生物分解的形態(tài)[3]。2.2合成高分子材料目前，市面上現(xiàn)有的高分子材料主要有聚乙烯、聚酯等。劉萬強(qiáng)[4]，等覺得為了讓原始方法生成的PLA的分子量不太大，為了改善材料的脆度大的問題，作為擴(kuò)鎖劑，通過熔融的擴(kuò)展具備乳酸。但是因?yàn)檫^程反應(yīng)過于劇烈，在聚乳酸的分子鏈中導(dǎo)入了新的填埋，加大了材料的分子量。20世紀(jì)30年代，美國的化學(xué)家Caroshes.W.H利用收縮反應(yīng)制得的乳酸[5]，不符合高分子量的標(biāo)準(zhǔn)。上世紀(jì)七十年代后，乳酸的生產(chǎn)工藝被完善，產(chǎn)物的分子量逐漸符合要求，特別是前20年，已經(jīng)找到了完善的乳酸合成方法，例如利用高沸點(diǎn)溶劑加入到乳酸的生產(chǎn)過程中，有助于乳酸分子量的增加。王錫建等人提出了用容體纖維法降解材料的方法，同時(shí)對(duì)制成材料的結(jié)晶度以及相容性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。PCL影響PCL的結(jié)晶機(jī)理和結(jié)晶速率。PCL的晶型保持不變。PCL不影響PCV的結(jié)晶機(jī)理。降低PCL的結(jié)晶速率，改變PCV的晶型。間接polyA合成是一種常用的制成高分子乳酸的方法，為了降低產(chǎn)物的分子量，需要在高溫下進(jìn)行裂解。2.3聚氨酯材料的改性研究聚氨酯（PU）具有良好的物理機(jī)械性能和優(yōu)異的生物相容性和降解性，使其被譽(yù)為“理想的生物材料”，可用于制造各種醫(yī)療機(jī)器和器械。許多人造器官和醫(yī)療器械都受到了嚴(yán)重的傷害。它發(fā)揮了重要作用。聚氨酯作為生物醫(yī)用材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有良好的生物相容性，可根據(jù)材料在37C時(shí)的硬度根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。溶出體外量小，阻力好，物理機(jī)械性能廣，加工性好，表面光滑。Gelim、WuRong等人用乙醇兩種方法合成了芳香族聚酯酰胺：乙醇用于合成丙烯酸乙醇，再由鄰苯二甲酸和二乙酸乙酯結(jié)合。這些PA是高模材料，很難減少芳香結(jié)構(gòu)的存在。然而，聚氨酯材料的生物相容性不能滿足臨床器官移植的要求。因此，對(duì)聚氨酯進(jìn)行改進(jìn)以獲得聚氨酯的特異性是當(dāng)前研究的課題。人們使用聚氨酯和聚丙烯酸酯來改善其系統(tǒng)的相容性。2.4生物可降解材料的應(yīng)用1.3.1在生物醫(yī)藥科技領(lǐng)域的應(yīng)用因?yàn)樯锝M織的相容性更強(qiáng)，也不含毒性，經(jīng)常被用于我國的醫(yī)藥生產(chǎn)以及各種醫(yī)用產(chǎn)品的研究。當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)主要有以下幾個(gè)用處：（1）能夠幫助給藥系統(tǒng)快速將藥物成分遞送到患者患處的一種載體。釋放的可生物降解物質(zhì)直接溶解并聚集到體內(nèi)，然后通過手術(shù)去除。（2）手術(shù)縫合。可生物降解材料根據(jù)人體組織優(yōu)異的生物相容性，具有手術(shù)縫合線所需的強(qiáng)度和韌性。因?yàn)槿梭w對(duì)其排異反應(yīng)并不是很高，其也被用到了手術(shù)縫合線的生產(chǎn)過程當(dāng)中，骨科手術(shù)所用到的骨釘和骨板的生產(chǎn)也需要用到這種材料?？晌湛p合線的出現(xiàn)使得病人不用受到拆線的二次傷害，讓病人可以恢復(fù)的更快。（3）生物組織一般遵循“先分解，再生成”的工作步驟，被分解的物質(zhì)，在這一過程中被排到體外，而生物組織則能被人體吸收，所以能夠被用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的大部分材料都具有可吸收特性。2PET的生物降解2.1PET水解酶的概述聚對(duì)苯二甲酸乙二酯（PET）是世界上生產(chǎn)最多的聚酯塑料之一。我們生活中的大多數(shù)產(chǎn)品均由PET制造，如一次性飲料瓶，衣服，包裝和地毯。由于PET中酯鍵的可接近性有限，PET難以被生物解聚。過去幾年報(bào)道了多種可催化PET水解的酶，這些酶是有望替代傳統(tǒng)化學(xué)回收手段的生物催化劑。據(jù)報(bào)道，這些酶多存在于腐生菌或植物病原生物（包括真菌和細(xì)菌）中，抑或是存在于富含植物性有機(jī)物質(zhì)或塑料碎片的環(huán)境中，在極端情況下可利用PET為細(xì)胞生長(zhǎng)的主要碳源。目前，已知的所有PET水解酶均為角質(zhì)酶或羧酸酯酶，它們都屬于α/β-水解酶超家族，具有高度序列同一性和結(jié)構(gòu)相似性，活性位點(diǎn)內(nèi)關(guān)鍵殘基的取代可以使PET水解酶具水解PET的能力。迄今為止，已經(jīng)鑒定出許多可水解PET的酶（PHE），表2-1總結(jié)了現(xiàn)已被生化表征的PHE。表2-1具有已知氨基酸序列的生化表征PET水解酶（PHE）AcidSequence酶登記號(hào)來源脂肪酶StreptomycesexfoliatusBTA-1AJ810119.1Thermobifidafusca

DSM43793BTA-2Thermobifidafusca

DSM43793TfHWP_011291330.1Thermobifidafusca

DSM43793Tfu_0882AAZ54920.1ThermobifidafuscaYXTfu_0883AAZ54921.1ThermobifidafuscaWSH03-11TfCut1CBY05529.1ThermobifidafuscaKW3TfCut2CBY05530.1ThermobifidafuscaKW3Est1BAI99230.2ThermobifidaalbaAHK119Est119BAK48590.1ThermobifidaalbaAHK119LCCAEV21261.1MetagenomefromleafbranchcompostFsC1CEXFusariumsolani

pisiThcCut1ADV92526.1Thermobifidacellulosilytica

DSM44535ThcCut2ADV92527.1Thermobifidacellulosilytica

DSM44535Thf42_Cut1ADV92528.1Thermobifidafusca

DSM44342Tha_Cut1ADV92525.1Thermobifidaalba

DSM43185Thh_EstAFA45122.1Thermobifidahalotolerans

DSM44931TfAXEADM47605.1ThermobifidafuscaNTU22Cut1JN129499.1ThermobifidafuscaNRRLB-8184Cut2JN129500.1ThermobifidafuscaNRRLB-8184Cut190AB728484.1Saccharomonosporaviridis

AHK190HiC4OYYHumicolainsolensBsEstBADH43200.1Bacillussubtilis

4P3-11PET2C3RYL0unculturedbacteriumPET5R4YKL9Oleispiraantarctica

RB-8PET6UPI0003945E1FVibriogazogenesPET12A0A0G3BI90PolyangiumbrachysporumPETaseGAP38373.1Ideonellasakaiensis

201-F6Tcur0390CDN67546.1Thermomonosporacurvata

DSM43183Tcur1278CDN67545.1Thermomonosporacurvata

DSM431832.2PET水解酶的研究進(jìn)展可水解PET的酶主要分為PET表面修飾酶和PET水解酶兩類。圖2-1PET膜的圖像及其與酶攻擊的關(guān)系PET中包含非常少量的MHET環(huán)狀三聚體，存在于聚合物嵌段的內(nèi)部或外部。當(dāng)PET表面有環(huán)狀三聚體或聚合物鏈的任何末端/環(huán)時(shí)，它會(huì)受到各種水解酶的攻擊而產(chǎn)生少量產(chǎn)物（如MHET，BHET和TPA）。PET的主體在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）以下極難被酶降解。因此，在低水平（<1~2％）下檢測(cè)到MHET，BHET或TPA只能表明其對(duì)PET進(jìn)行了表面改性。如果能降解PET主體，必然會(huì)釋放大量的產(chǎn)物（1mgPET相當(dāng)于約5.2μmolMHET）。許多酶（如脂肪酶，角質(zhì)酶，酯酶，羧酸酯酶和木瓜蛋白酶）只能水解表面，無法降解主體，可將這些酶被歸類為PET表面修飾酶。此外，將可在最佳反應(yīng)溫度（<65~70℃）的條件下，顯著降解PET主體的酶被歸類為PET水解酶（圖2.1）。2016年，Yoshida等人分離出的菌株（Ideonellasakaiensis201-F6），可以在30℃以無定形PET為主要碳源，實(shí)現(xiàn)對(duì)PET的水解。該菌株可產(chǎn)生兩種酶：聚（對(duì)苯二甲酸乙二醇酯）水解酶（IsPETase）和單-（2-羥乙基）對(duì)苯二甲酸水解酶（IsMHETase），二者結(jié)合，可在30℃將PET降解為TPA和EG。IsPETase在30℃時(shí)的降解能力顯著高于角質(zhì)酶LCC，TfH和ThcCut1。盡管近年來，IsPETase已經(jīng)成為PET水解領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但與其他已知PET水解酶的高降解能力（總產(chǎn)物水平為數(shù)十毫摩爾每升）相比，它對(duì)PET的降解能力其實(shí)很低（總產(chǎn)物水平最高為10μM），而且耐久性差（在37℃存放12小時(shí)即會(huì)損失大部分活性）。Kawai等人認(rèn)為，目前所有已知的PET水解酶都是角質(zhì)酶（表2-2）。表2-2PET水解酶酶來源反應(yīng)條件降解度（％）底物PETTfHThermobifidafuscaDSM4379355℃≈50（失重）熔壓飲料瓶TfCut2變體T.fuscaKW365℃≤45（失重）無定形膜和聚酯纖維Cut190變體SaccharomonosporaviridisAHK19070℃33.6±3.0（吸收）聚酯纖維60℃59.2±2.1（吸收）PET包裝袋LCC植物堆肥的基因組50~70℃≤25（失重）PET包裝袋HiCHumicolainsolens70℃97±3（NaOH滴定）聚酯纖維PET水解酶均為角質(zhì)酶，主要包括ThcCut1、ThcCut2、TfCut2，LCC及其變體。角質(zhì)酶（EC3.1.1.74）屬于絲氨酸水解酶超家族，具有典型的催化三聯(lián)體Ser-His-Asp和氧陰離子孔。角質(zhì)酶能夠在體外催化酯水解反應(yīng)（水性環(huán)境）及大分子和小分子的酯化和酯交換反應(yīng)（無水條件）。此外，角質(zhì)酶具有開放的活性口袋，沒有蓋子，口袋很淺，可以容納龐大的聚酯鏈，并使其在催化三聯(lián)體中被活性絲氨酸所利用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA。本課題使用的角質(zhì)酶來源于不同的菌種，其中ThcCut1（GenBank：ADV92526.1）和ThcCut2（GenBank：ADV92527.1）均來源于

Thermobifidacellulosilytica

DSM44535，TfCut2（GenBank：CBY05530.1）來源于ThermobifidafuscaKW3，LCC（GenBank：AEV21261.1）來源于采用宏基因組學(xué)方法從葉分支堆肥中分離出的新型角質(zhì)酶。來自Thermobifida的角質(zhì)酶序列都非常相似，但它們對(duì)PET的水解活性卻有很大不同。有報(bào)道表示，從PET水解中釋放出的產(chǎn)物對(duì)Thermobifida來源角質(zhì)酶的活性具有抑制作用。為解決該問題，Barth等人利用超濾膜反應(yīng)器連續(xù)去除抑制性水解產(chǎn)物，將PET水解效率提高了70%；他們還向PET降解體系中引入了可高效降解中間產(chǎn)物MHET的羧酸酯酶——Tfca（SequenceID：P86325.1，來源于ThermobifidafuscaKW3），所構(gòu)建出的LCC-Tfca雙酶降解體系相對(duì)于LCC游離酶，將PET水解釋放產(chǎn)物增加了104%，TfCut2-Tfca雙酶體系也提高了91%；Carniel等人以相同思路構(gòu)建的HiC-CALB雙酶協(xié)同體系，相對(duì)于HiC體系而言，提高了7.7倍的產(chǎn)物量。為解除產(chǎn)物抑制，Wei等人利用TfCut2與LCC之間的序列和結(jié)構(gòu)相似性，通過改造TfCut2中參與底物結(jié)合的的部分氨基酸殘基，構(gòu)建了TfCut2-G62A突變體，將TfCut2的水解速率常數(shù)提高了3倍。Ribitsch等人通過模型分析發(fā)現(xiàn)，源于嗜熱菌的不同角質(zhì)酶對(duì)聚酯的水解效率存在較大差異，這可能是由于不同的酶在活性位點(diǎn)附近的靜電作用力和表面疏水性質(zhì)都有所不同。因此，Ribitsch等人將ThcCut1與來自Alcaligenesfaecalis的疏水結(jié)合模塊PBM融合，表達(dá)出的融合酶對(duì)PET的吸附效果顯著增加，PET水解活性是原生酶的4倍左右；他們還將ThcCut1與II類疏水蛋白HFB4和HFB7共價(jià)融合，比游離酶的PET降解水平高出16倍以上；其他誘變實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這種方法的有效性，研究人員對(duì)來自Thermobifidafusca、Fusariumsolanipisi和Clostridiumbotulinum角質(zhì)酶活性部位附近的區(qū)域進(jìn)行了突變，以提高其表面疏水性，最終所得突變體的PET水解性能得到了改善。眾所周知，PET自身的物理性質(zhì)也對(duì)酶促水解有重大影響。在PET的酶促水解過程中，使用FTIR可以觀察到PET中結(jié)晶域的增加，這表明無定形的PET會(huì)被優(yōu)先水解，該觀點(diǎn)在一些比較不同結(jié)晶度材料的降解研究中也得到了證實(shí)。此外，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）也會(huì)影響聚合物的降解，接近Tg的酶水解使聚酯鏈具有更好的柔性，酯鍵進(jìn)入水解酶活性位點(diǎn)的可能性更高。PET在空氣中的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）約為70-80℃，在水中可以降低約10℃。在接近其Tg的反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶水解，可以導(dǎo)致lcPET薄膜的有效降解，PET水解反應(yīng)溫度的升高會(huì)導(dǎo)致PET降解速度的加快。因此，提高PET水解酶的熱穩(wěn)定性至關(guān)重要，Then等人研究發(fā)現(xiàn)Ca2+和Mg2+的添加可顯著提高來自Thermobifidafusca的聚酯水解酶（TfH，BTA2，Tfu_0882，TfCut1和TfCut2）對(duì)PET薄膜的降解，通過用帶正電荷的精氨酸替換Ca2+結(jié)合位點(diǎn)（Asp174，Asp204和Glu253）的酸性殘基，提高了TfCut2的熱穩(wěn)定性；此外，他們還以二硫鍵取代TfCut2的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，增加了其熱穩(wěn)定性和對(duì)聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯的活性，通過向鄰近殘基處引入進(jìn)一步的突變，所獲得的TfCut2-D204C/E253C/D174R變體，將反應(yīng)最佳溫度提高了約10℃。Tournier等人對(duì)LCC采用了相同的突變策略，在二價(jià)金屬結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建二硫鍵，設(shè)計(jì)了D238C/S283C變體，酶熱穩(wěn)定性增加，在此基礎(chǔ)上引入了前期實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致最高比活性的兩個(gè)突變和可提高熱穩(wěn)定性的幾個(gè)突變，最終獲得了效果最好的兩個(gè)突變體F243I/D238C/S283C/Y127G（ICCG）和F243W/D238C/S283C/Y127G（WCCG），可在10小時(shí)內(nèi)降解90%以上的PET粉末（先將消費(fèi)后PET無定形化后，再進(jìn)行造粒），為現(xiàn)今活性最強(qiáng)的PET水解酶。通過生物技術(shù)進(jìn)行的酶優(yōu)化在某種程度上取得了成功，但到目前為止還沒有研究出一種能以經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)保的方式完全滲透和降解厚層高結(jié)晶PET的酶。2.3PET水解產(chǎn)物的分析方法2.3.1高效液相色譜（HPLC）分析色譜法是一種基于分子結(jié)構(gòu)與組成不同而分離的分析技術(shù)。色譜分離可以使用不同的固定相，如固定在玻璃板上的二氧化硅（薄層色譜），揮發(fā)性氣體（氣相色譜），紙張（紙色譜）和液體（液體色譜）。高效液相色譜法（HPLC）是一種液相色譜法，用于分離和定量溶解在溶液中的化合物，通常用于確定溶液中特定化合物的含量。PET水解酶的酶活性可以通過對(duì)形成的水溶性降解產(chǎn)物（如TPA）進(jìn)行定量來確定，由于其在240nm處具有特征吸收，TPA和相關(guān)的酯（如對(duì)MHET和BHET）可以通過反相HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，是目前最常用的PET水解產(chǎn)物分析方法。2.3.2對(duì)苯二甲酸（TPA）熒光檢測(cè)對(duì)苯二甲酸以對(duì)苯二甲酸酯的形式溶于堿性緩沖液中，可通過游離羥基自由基轉(zhuǎn)化為2-羥基對(duì)苯二甲酸酯（HOTP），從而能夠利用熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定（圖2-2）。由于對(duì)苯二甲酸酯具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)，它可被羥基化為一種單羥基化異構(gòu)體，該異構(gòu)體在室溫下，可在36小時(shí)內(nèi)顯示出穩(wěn)定的熒光。因此，TPA曾被用于定量游離羥基自由基。圖2-2鐵自氧化作用介導(dǎo)的對(duì)苯二甲酸酯羥基化為熒光HOTP的示意圖2.3.3紫外分光光度法原理同2.3.1相似，TPA在240nm波長(zhǎng)處具有特征吸收，其在微堿性（pH=7~9）溶液中的吸光度可以保持相對(duì)穩(wěn)定。該法極其簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)苯二甲酸酯在240nm左右也具有特征吸收峰，此外蛋白質(zhì)在該區(qū)域也會(huì)強(qiáng)烈吸收，實(shí)際應(yīng)用時(shí)測(cè)量誤差較大。Ma等人利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，排除了菌體對(duì)吸光度的影響，使用pRSET-CFP（青色熒光蛋白）載體表達(dá)PETase-CFP融合蛋白，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度來表征蛋白表達(dá)水平，240nm處檢測(cè)產(chǎn)物吸光度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PET水解酶的高通量篩選。朱麗姍等人還優(yōu)化了紫外分光光度法波長(zhǎng)的選擇，使用微孔濾膜采集空氣中TPA，由于濾膜本身在240nm處的底值偏高且不規(guī)律。對(duì)空白濾膜及TPA標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)濾膜在250nm后幾乎沒有紫外吸收，基本不影響測(cè)定，但TPA在250~260nm也有很大吸收，經(jīng)過條件優(yōu)化后，選擇260nm為試驗(yàn)波長(zhǎng)。此外，Zhong等人也在260nm處實(shí)現(xiàn)了所有IsPETase同源酶的活性測(cè)定。2.4PET水解酶的活性測(cè)定方法2.4.1對(duì)硝基苯酚法以對(duì)硝基苯酯為底物，測(cè)量生色基團(tuán)（對(duì)硝基苯酚）的釋放，對(duì)硝基苯酚在405nm或410nm處有最大吸收峰，可通過紫外分光光度法進(jìn)行產(chǎn)物吸光度的檢測(cè)。此方法非常簡(jiǎn)單，但將棕櫚酸酯釋放到水性介質(zhì)中時(shí)會(huì)產(chǎn)生渾濁，需要添加乳化劑或有機(jī)溶劑（乙醇或丙醇）以保持其均一性，而有機(jī)溶劑難以測(cè)量和處理。目前常用于PET水解酶的對(duì)硝基苯酯底物主要有p-NPA、p-NPB、p-NPH等。2.4.2快速比色法Shinozaki等人利用尼羅藍(lán)染色試劑對(duì)生物可降解塑料（BPs）進(jìn)行染色，制備出含染料的生物可降解塑料薄膜，進(jìn)行酶促反應(yīng)后，可以觀察到反應(yīng)溶液的顏色變化，反應(yīng)進(jìn)程可通過OD600進(jìn)行測(cè)定。操作流程如圖2-3所示，其中（A）為載玻片上的BP膜和酶溶液的剖視圖；（B）為反應(yīng)后（30℃，24h）的帶有BP膜和酶溶液的載玻片的照片；（C）為在含染料的BP膜降解后收集的反應(yīng)溶液。圖2-3使用含染料的BP膜（染料-BP分析）評(píng)估相對(duì)BPs降解活性2.4.3快速比濁法Wei等人將PET納米顆粒固定在瓊脂糖凝膠中，通過測(cè)量PET水解過程中，由于散射效應(yīng)引起的透射光強(qiáng)度的變化，來確定來自Thermobifidafusca

KW3的聚酯水解酶（TfCut2）對(duì)PET水解的程度。PET納米顆粒懸浮液的濁度降低與酶降解產(chǎn)生的表面侵蝕過程相關(guān)，可以基于非均相生物催化模型直接估算PET酶水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。此外，Schmidt等人還使用比濁法分析了聚酯水解酶LCC，TfCut2，Tcur1278和Tcur0390對(duì)聚酯PUImpranilDLN的降解，其中TfCut2和Tcur0390具有最高的聚氨酯水解速率。3PET降解工藝3.1酶的純化方式為了研究和應(yīng)用酶的有效特性，需要在異源表達(dá)過程中純化酶，從而避免雜質(zhì)影響酶的催化效率。因此，在催化應(yīng)用之前，應(yīng)當(dāng)先通過物理方法對(duì)酶進(jìn)行純化。常見蛋白純化方式如表3-1所示。表3-1常見蛋白純化方式及其優(yōu)缺點(diǎn)常用純化方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)硫酸銨沉淀法蛋白質(zhì)溶解度基于離子強(qiáng)度的降低簡(jiǎn)單且有效，便宜，回收率高，添加劑少，可以用作進(jìn)一步分析之前的分析前步驟。沉淀出的蛋白難以重新溶解，并且可能發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量和活性的嚴(yán)重?fù)p失，從而使整個(gè)純化工作的成本過高；不普適。蔗糖密度梯度超速離心根據(jù)蛋白浮游密度的差別進(jìn)行分析的一種沉降平衡法簡(jiǎn)單，較為便宜，無毒耗時(shí)，解析度差，難以擴(kuò)大，且不普適。離子交換色譜靜電相互作用解析度高，具有自動(dòng)化和按比例放大的可行性，可與其他非變性技術(shù)正交使用。成本高，過程復(fù)雜，由于結(jié)合所需的低電導(dǎo)率，緩沖液用量大。親和色譜親和作用特異性強(qiáng)，純度高，容量大；自動(dòng)化程度高，因此操作簡(jiǎn)便，快速，通量較高。成本高，回收率低，過程復(fù)雜，低pH洗脫還可能導(dǎo)致昂貴的配體浸出和變性。這些蛋白質(zhì)純化方法的共同特征是純化后會(huì)產(chǎn)生廢料，從而引起環(huán)境問題。例如，鎳柱純化方法是親和色譜中常用的純化方法之一。雖然純化效果更好，但會(huì)產(chǎn)生大量的含鎳離子的瓊脂糖廢料和咪唑廢料，不利于回收利用，還會(huì)增加固液排放量。這不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，離子暴露還可能會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激性副作用；此外，在該過程中，還需要進(jìn)一步濃縮和過濾以除去咪唑，步驟繁瑣且不適合工業(yè)化應(yīng)用。為了提高酶純化過程的實(shí)用性，從PET水解酶的耐熱性角度出發(fā)，可以通過升高溫度，使雜蛋白變性并沉淀，從而促進(jìn)水解酶的純化。為了避免在熱純化過程中，由于短期加熱而導(dǎo)致的目標(biāo)蛋白聚集與沉淀的損失，熱休克蛋白的共表達(dá)也可以輔助提高酶的耐熱性。熱處理半純化方法已被用于LCC酶ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA的純化，但尚未進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化研究。本課題探索和優(yōu)化了不同PET水解酶的熱純化條件，以提高其純化效果，并為具有更好熱穩(wěn)定性的酶提供了一種新的純化方法。3.2反應(yīng)體系的預(yù)處理3.2.1PET納米顆粒的制備采用酶法對(duì)PET進(jìn)行水解，主要是一個(gè)表面侵蝕過程，由于尺寸的限制，酶分子難以直接進(jìn)入聚合物內(nèi)部進(jìn)行降解。因此，可通過降低聚酯的粒徑尺寸，提高聚酯的比表面積，從而增加酶與底物的可及性。Wei等人利用再生PET顆粒，PET薄膜和PET纖維分別制備了三種PET納米顆粒，通過對(duì)三者的水解速率常數(shù)和酶水解的吸附平衡常數(shù)的比較，PET的生物降解性主要受到聚酯鏈遷移率的影響，這決定了酶與酯鍵的親和性和可及性。3.2.2堿水解預(yù)處理Septevani等人對(duì)PET膜進(jìn)行堿水解預(yù)處理（圖3-1），大大增強(qiáng)了膜表面的親水性。通過水解對(duì)PET進(jìn)行表面改性，主要是利用PET中的酯鍵與NaOH之間的反應(yīng)，引起PET的表面侵蝕，從而導(dǎo)致聚合物鏈表面形成羥基和羧基。圖3-1MNaOH處理前后膜表面形態(tài)變化3.2.3表面活性劑預(yù)處理此前，有研究表明，向HiC酶中添加兩親疏水蛋白后，HiC酶催化活性得到