第十三章臨床微生物標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測

第十三章臨床微生物標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測第一節(jié)血液及骨髓標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征1．懷疑菌血癥、真菌菌血癥、敗血癥、腦膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、感染性心內(nèi)膜炎及不明病原發(fā)熱等情況下均應(yīng)在未進(jìn)行系統(tǒng)性抗菌藥物治療前，及時(shí)進(jìn)行血液培養(yǎng)，患者出現(xiàn)以下癥狀、體征時(shí)可作為采集血培養(yǎng)的重要指征。寒戰(zhàn)伴發(fā)熱(≥38℃)或低溫(≤36白細(xì)胞增多(＞10×109/L)，特別有“核左移”未成熟的或帶狀的白細(xì)胞增多；粒細(xì)胞減少(成熟的多核白細(xì)胞＜1×109/L)；血小板減少，皮膚黏膜出血；昏迷，多器官功能衰竭；或同時(shí)具備上述幾種體征時(shí)應(yīng)采血培養(yǎng)。2．新生兒懷疑菌血癥時(shí)，還須同時(shí)做尿液和腦脊液培養(yǎng)。3．老年菌血癥患者可能不發(fā)熱或不低溫，如伴有身體不適、肌痛或中風(fēng)，可能是感染性心內(nèi)膜炎，也應(yīng)進(jìn)行血培養(yǎng)。4．骨髓培養(yǎng)與血液培養(yǎng)的送檢指征是基本一致的，臨床常規(guī)血液感染有指征時(shí)以抽取血培養(yǎng)為主。但當(dāng)骨髓炎時(shí)或長期使用抗菌藥物患者，抽取骨髓培養(yǎng)陽性率會(huì)遠(yuǎn)高于血培養(yǎng)。5．各種無菌體液標(biāo)本，如胸腹水、漿膜腔積液及各種穿刺液等亦可注入血培養(yǎng)瓶以提高培養(yǎng)的陽性率。二、血培養(yǎng)次數(shù)和采血時(shí)間(一)總的采血原則采血培養(yǎng)應(yīng)該盡量在使用抗菌藥物之前進(jìn)行(心內(nèi)膜炎除外)，在24小時(shí)內(nèi)采集2～3份血培養(yǎng)(一次靜脈采血注入多個(gè)培養(yǎng)瓶中應(yīng)視為單份血培養(yǎng))。如有可能最好同時(shí)做厭氧菌培養(yǎng)。對(duì)間歇性寒戰(zhàn)或發(fā)熱的患者，應(yīng)在寒戰(zhàn)或體溫高峰到來之前0.5～1小時(shí)采集血液，或于寒戰(zhàn)或發(fā)熱后1小時(shí)采集，因?yàn)榘l(fā)熱時(shí)血液中可能沒有細(xì)菌。在采集血培養(yǎng)后的2～5天內(nèi)不需要再重復(fù)采血培養(yǎng)(除外心內(nèi)膜炎和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥)，因?yàn)檫M(jìn)行治療后的2～5天血液中的感染細(xì)菌不會(huì)馬上消失。(二)特殊的全身性和局部感染患者采血培養(yǎng)的建議1．可疑急性原發(fā)性菌血癥、真菌菌血癥、急性腦膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌性肺炎、腎盂腎炎發(fā)熱患者，應(yīng)在不同部位(如兩臂)采集2～3份血標(biāo)本(應(yīng)在抗生素治療前完成)。2．不明原因發(fā)熱，如隱性膿腫，傷寒熱和波浪熱，第1天內(nèi)相隔1小時(shí)在不同部位連續(xù)采集2～3份血標(biāo)本，當(dāng)培養(yǎng)24～48小時(shí)后若為陰性，應(yīng)再采集2～3份血培養(yǎng)。3．可疑菌血癥或真菌菌血癥，但血培養(yǎng)持續(xù)陰性，應(yīng)改變血培養(yǎng)方法，以獲得罕見的或苛養(yǎng)的微生物。4．可疑細(xì)菌性心內(nèi)膜炎：急性病例，在抗生素治療或改變前1～2小時(shí)內(nèi)從不同部位采集3份血標(biāo)本；亞急性病例，第1天24小時(shí)內(nèi)相隔1小時(shí)連續(xù)采集3次血標(biāo)本，若24～48小時(shí)全部陰性，再采集2～3次血標(biāo)本；若已經(jīng)抗生素治療患者，連續(xù)3天，每天取2次血標(biāo)本，可選用能中和或吸附抗菌藥物的培養(yǎng)基。三、采集部位及血量以無菌方法從患者肘靜脈或股動(dòng)脈采血。采血量以培養(yǎng)基的1/10為宜，成人采血量8～10ml，兒童3～5ml，嬰幼兒為1～2ml。四、采血操作流程和要求1．先準(zhǔn)備好采血用具(手套、止血帶、注射器、血培養(yǎng)瓶、消毒劑、棉簽等)并將貼有條形碼的血培養(yǎng)瓶準(zhǔn)備好。2．戴好帽子、口罩進(jìn)行操作，采血前應(yīng)先洗手。3．皮膚消毒前，先檢查血培養(yǎng)瓶有無損壞或超過保質(zhì)期，用75％酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞，待干燥60秒。4．系上止血帶，用沾有0.2％碘醇消毒劑的棉簽，以穿刺點(diǎn)為圓心，以約5cm直徑畫圈進(jìn)行皮膚消毒，作用時(shí)間至少30秒，待干燥后穿刺采血。注意消毒過的地方不能重復(fù)涂抹，在涂抹的過程中棉簽必須也要同時(shí)旋轉(zhuǎn)。如果患者手臂皮膚不夠干凈，則需重新5．用注射器穿刺取血后，排盡針頭內(nèi)空氣，勿換針頭，(如果行第2次穿刺，應(yīng)換針頭)，直接注入消毒后的血培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻以防止血液凝固。五、標(biāo)本運(yùn)送1．采集后血培養(yǎng)瓶應(yīng)立即送到微生物實(shí)驗(yàn)室，一般不得超過2小時(shí)。2．如因某種原因不能及時(shí)送檢，應(yīng)將已采集好的血液培養(yǎng)瓶放在室溫，切勿放入冰箱內(nèi)冷藏或冷凍。六、注意事項(xiàng)1．標(biāo)本采集過程中必須嚴(yán)格無菌操作，以免將污染菌誤以為病原菌。2．要保證足夠的標(biāo)本量，以提高血液或骨髓培養(yǎng)的陽性率。3．待乙醇完全干燥后再采血，以防消毒劑被帶入。4．對(duì)已用抗菌藥物輸液不能中止的患者，應(yīng)在下次用藥之前采集標(biāo)本，最好進(jìn)行連續(xù)性動(dòng)態(tài)血培養(yǎng)觀察。5．對(duì)已用抗菌藥物治療的患者可以使用含中和劑的樹脂血瓶，對(duì)高度懷疑厭氧菌和真菌感染的患者，可以使用厭氧血瓶和真菌血瓶，對(duì)血液患者及小兒可以使用專用血瓶進(jìn)行血培養(yǎng)。七、檢驗(yàn)方法一般血液或骨髓培養(yǎng)推薦同時(shí)送檢需氧及厭氧血培養(yǎng)，因厭氧菌血液感染約占菌血癥病原菌的5％～15％。(一)傳統(tǒng)手工血培養(yǎng)檢驗(yàn)方法1．培養(yǎng)及轉(zhuǎn)種：將血液或骨髓標(biāo)本注入培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)瓶系實(shí)驗(yàn)室自行配制或成品血培養(yǎng)瓶)。置于35℃恒溫箱內(nèi)，每日觀察并記錄培養(yǎng)瓶的變化，包括肉湯混濁度、沉淀、菌膜、溶血、色素等，雙相培養(yǎng)瓶肉湯如有異常，或瓊脂斜面上有菌苔、菌落出現(xiàn)，應(yīng)及時(shí)涂片、革蘭染色鏡檢，并根據(jù)涂片的細(xì)菌形態(tài)與染色性選擇相應(yīng)的分離培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)種。轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基分別為血平板、巧克力平板、麥康凱、沙保弱、高滲平板等。通常肉湯培養(yǎng)72．如為厭氧培養(yǎng)瓶：則瓶內(nèi)含85％N2、10％CO2、5％H2，厭氧瓶為密閉型，需逐日觀察瓶內(nèi)肉湯的變化，若需氧瓶無變化，厭氧瓶肉湯有變化，即可考慮有厭氧菌生長，應(yīng)進(jìn)行涂片及轉(zhuǎn)種厭氧血平板后置厭氧環(huán)境進(jìn)行分離培養(yǎng)，應(yīng)注意避免氧氣進(jìn)入培養(yǎng)瓶。3．適當(dāng)運(yùn)用盲轉(zhuǎn)法可提高陽性率：血培養(yǎng)12小時(shí)后如無明顯變化，可盲轉(zhuǎn)1次，同時(shí)涂片革蘭染色鏡檢，可提高陽性率。4．血培養(yǎng)的三級(jí)報(bào)告方式。(1)一級(jí)報(bào)告：血及骨髓培養(yǎng)當(dāng)觀察到疑有細(xì)菌生長時(shí)，應(yīng)以無菌操作方式挑取培養(yǎng)液進(jìn)行涂片，革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有菌生長并排除污染菌時(shí)，應(yīng)立即將肉湯轉(zhuǎn)種血平板和巧克力平板；厭氧菌轉(zhuǎn)種厭氧血平板，進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，并將鏡檢結(jié)果、細(xì)菌形態(tài)及染色性報(bào)告臨床醫(yī)師，以供初步選擇使用抗菌藥物。(2)二級(jí)報(bào)告：轉(zhuǎn)種平板培養(yǎng)結(jié)果于8～12小時(shí)，或獲初步鑒定和藥物敏感試驗(yàn)報(bào)告，應(yīng)立即通知臨床醫(yī)師，此為二級(jí)報(bào)告。(3)三級(jí)報(bào)告：將分離菌最終鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果與初級(jí)報(bào)告比對(duì)，作出最終正式報(bào)告，通知臨床以檢查用藥正確與否或更改治療方案。(4)不同目的菌的報(bào)告時(shí)間：一般細(xì)菌培養(yǎng)7天無菌生長可發(fā)出報(bào)告；厭氧菌應(yīng)培養(yǎng)2周發(fā)出報(bào)告；亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、布魯菌、真菌血培養(yǎng)及鉤端螺旋體如7天為陰性可繼續(xù)培養(yǎng)，延至4周發(fā)出報(bào)告。(二)自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)方法1．將血液或骨髓標(biāo)本注入商品血培養(yǎng)瓶中，置于自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，不同培養(yǎng)儀通過不同原理可監(jiān)測出培養(yǎng)液的變化，隨時(shí)發(fā)出警鈴告示。2．用無菌注射器將報(bào)警之培養(yǎng)液抽出并轉(zhuǎn)種血瓊脂平板和巧克力平板或厭氧血平板，35℃孵育，同時(shí)作涂片鏡檢和直接藥敏試驗(yàn)，再按三級(jí)報(bào)告程序進(jìn)行，厭氧培養(yǎng)按厭氧3．若在預(yù)定期限未出現(xiàn)陽性結(jié)果，可發(fā)出陰性結(jié)果報(bào)告。(三)特殊細(xì)菌培養(yǎng)方法1．分支桿菌血培養(yǎng)：可用特殊培養(yǎng)基接種血標(biāo)本、BACTEC13A培養(yǎng)基為分離血液中分支桿菌的專用培養(yǎng)基，采血量為5ml；此外，使用裂解一離心技術(shù)、BACTEC12B、Bact/A-1ert(r)MP2．L型細(xì)菌血培養(yǎng)：將血液標(biāo)本注入高滲培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可分離出細(xì)胞壁缺陷病原菌(即L型細(xì)菌)。3．真菌血培養(yǎng)：使用需氧血培養(yǎng)瓶、雙相培養(yǎng)基、裂解一離心技術(shù)或腦心浸液肉湯均可分離到血液中的真菌，一般念珠菌培養(yǎng)5～7天即可生長，陰性結(jié)果應(yīng)于22～30℃孵育44．苛養(yǎng)菌培養(yǎng)：對(duì)疑為某些營養(yǎng)要求苛刻、生長速度遲緩的革蘭陰性桿菌(如嗜沫嗜血桿菌、伴放線桿菌、金氏桿菌、軍團(tuán)菌、布魯菌等)引起的心內(nèi)膜炎血培養(yǎng)標(biāo)本，主張延長培養(yǎng)時(shí)間至2～4周，并轉(zhuǎn)種特殊營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。5．營養(yǎng)變異鏈球菌：該菌需在含有巰醇復(fù)合物和維生素B6。培養(yǎng)基中生長，因此傳代培養(yǎng)中宜補(bǔ)充0.001％鹽酸一吡哆醛和0.05％～0.1％L型半胱氨酸促進(jìn)生長；也可將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于血瓊脂平板上，然后交叉畫線接種金黃色葡萄球菌ATCC25923(因其為室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株，易于獲得且較穩(wěn)定)，在金黃色葡萄周圍可見營養(yǎng)變異鏈球菌衛(wèi)星樣生長菌落。八、臨床意義正常人血液和骨髓是無菌的，血液與骨髓培養(yǎng)對(duì)血液感染的診斷具有非常重要的意義，被稱為金標(biāo)準(zhǔn)。由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，各種高效廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用、耐藥菌株不斷產(chǎn)生和播散、醫(yī)院感染率不斷上升，血培養(yǎng)分離菌的種類及數(shù)量不斷增加，條件致病菌和非致病菌也可引起免疫功能低下者嚴(yán)重的血液感染，除需氧菌、厭氧菌、真菌菌血癥外，有6％～15％的菌血癥為復(fù)數(shù)菌感染，長期使用抗生素者還會(huì)出現(xiàn)L型細(xì)菌感染，因此，臨床微生物工作者應(yīng)熟知感染菌變遷的動(dòng)向，準(zhǔn)確、快速地培養(yǎng)和鑒定出血液感染菌，并與臨床醫(yī)師經(jīng)常溝通，共同研討最佳抗感染化療方案，提高臨床治療水平。一般在排除外界污染，標(biāo)準(zhǔn)的無菌操作下，血液和骨髓培養(yǎng)分離菌應(yīng)為血液感染病原菌，可根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感抗生素進(jìn)行治療，選藥原則為選用敏感性高、價(jià)格合理、副作用小的藥物治療。九、血液感染常見病原菌血液與骨髓培養(yǎng)常見病原菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌兩大類型。(一)革蘭陽性菌1．革蘭陽性球菌：金黃色葡萄球菌(多為甲氧西林耐藥菌株)、凝固酶陰性葡萄球菌(多為甲氧西林耐藥菌株)、腸球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌等。2．革蘭陽性桿菌：產(chǎn)單核李斯特菌、分支桿菌(包括非典型結(jié)核桿菌)、炭疽芽孢桿菌等。(二)革蘭陰性菌1．革蘭陰性球菌：腦膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌等。2．革蘭陰性桿菌：傷寒沙門菌、非傷寒沙門菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、氣單胞菌、沙雷菌等。銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、流感嗜血桿菌等。(三)真菌白色念珠菌、其他念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等。(四)厭氧菌擬桿菌屬、具核梭桿菌、丙酸桿菌、消化球菌、韋榮球菌等。第二節(jié)痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征有下列體征之一，應(yīng)進(jìn)行痰培養(yǎng)：1．咳嗽、咳痰、痰液為膿性、血性、鐵銹色或紅棕色膠凍樣痰。2．咯血：包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等。3．呼吸困難、呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。4．發(fā)熱伴白細(xì)胞增高尤其是中性粒細(xì)胞或CRP明顯增高。5．胸部影像學(xué)檢查提示有感染可能。二、采集方法1．自然咳痰法：患者清晨起床后，用清水反復(fù)漱口后用力自氣管咳出第一口痰于無菌容器內(nèi)，立即送檢。痰液較深不易咳出時(shí)，可在咳痰前扣背協(xié)助排痰。對(duì)于痰量少或無痰的患者可采用霧化吸入加溫至45℃的10％NaC12．小兒取痰法：用彎壓舌板向后壓舌，將無菌棉拭子伸人咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時(shí)，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上。對(duì)咳痰量少的幼兒，可輕輕壓迫胸骨上部的氣管，使其咳嗽。3．支氣管鏡采集法：用支氣管鏡在肺內(nèi)病灶附近用導(dǎo)管吸引或用支氣管刷直接取得標(biāo)本。4．氣管切開者取痰法：消毒氣管套管口，以無菌吸痰管插入氣管抽吸痰液，注入無菌試管立即送檢。具體操作方法：①打開一次性吸痰管，接好負(fù)壓吸引器；②用左手拇指將接頭外折曲堵住并持吸痰管，右手持無菌鑷夾持吸痰管；③將吸痰管送到氣管最深處，刺激患者咳嗽，開放負(fù)壓吸引；④左手拇指松開吸引，見痰液吸入吸痰容器中時(shí)，左手拇指迅速將接頭折曲堵??；⑤拔出吸痰管，脫開吸引器接頭；⑥將痰液容器上與吸痰管連接的蓋子取下，將底部的蓋子蓋上；⑦在容器上注明患者姓名和科室后，立即送檢。三、標(biāo)本運(yùn)送痰標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，常規(guī)培養(yǎng)不超過2小時(shí)，送實(shí)驗(yàn)室后立即接種。四、注意事項(xiàng)1．采集標(biāo)本以清晨為佳，為減少口腔正常菌群污染標(biāo)本，采集前應(yīng)先用漱口液充分漱口。2．在應(yīng)用抗菌藥物之前采集標(biāo)本。3．做結(jié)核分支桿菌和真菌培養(yǎng)的標(biāo)本不能及時(shí)送檢的，可放4℃4．肺部感染的患者有25％～50％可能發(fā)生菌血癥，應(yīng)同時(shí)做血培養(yǎng)。5．采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)戴口罩和手套，避免交叉感染。五、檢驗(yàn)方法．(一)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查將痰標(biāo)本涂片后待干、固定、染色，或直接濕片鏡檢，對(duì)病原學(xué)早期、初步診斷有價(jià)值。濕片直接鏡檢以相差顯微鏡觀察效果好，對(duì)于一些特定的病原菌如軍團(tuán)菌、結(jié)核分支桿菌則用熒光顯微鏡檢測為佳。一般認(rèn)為合格的痰標(biāo)本應(yīng)是含白細(xì)胞、膿細(xì)胞和支氣管柱狀上皮細(xì)胞較多，而受污染的痰標(biāo)本則是來自頰黏膜的扁平鱗狀上皮細(xì)胞較多。以白細(xì)胞＞25個(gè)/低倍鏡視野，而鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)/低倍鏡視野為合格標(biāo)本。采集合格標(biāo)本對(duì)細(xì)菌的診斷尤為重要。1．一般細(xì)菌涂片檢查：進(jìn)行革蘭染色鏡檢，根據(jù)著色、形態(tài)及排列大致可以初步推斷菌屬(或種)，如見到革蘭陽性球菌、呈堆(葡萄狀)排列，疑似葡萄球菌；如見到瓜子形態(tài)、矛頭狀、尖端相背的成雙排列、可有莢膜的革蘭陽性球菌疑似肺炎鏈球菌等，可發(fā)出初步報(bào)告。2．結(jié)核桿菌涂片檢查：抗酸染色后，根據(jù)所見結(jié)果報(bào)告找到(或未找到)抗酸桿菌。3．放線菌以及奴卡菌涂片檢查：將痰液用生理鹽水反復(fù)洗滌數(shù)次，如含血液則加蒸餾水溶解紅細(xì)胞，挑取黃色顆粒(硫磺顆粒)或不透明的著色斑點(diǎn)，置玻片上加壓并覆以蓋玻片，高倍鏡下觀察其結(jié)構(gòu)，如見中央為交織的菌絲，其末端粗桿形呈放線狀排列時(shí)揭去蓋玻片，干后做革蘭及抗酸染色鏡檢。如查見中央部分菌絲為革蘭陽性，而四周放射的末梢菌絲為革蘭陰性，抗酸染色為非結(jié)核性者，可報(bào)告找到疑似放線菌。如查見革蘭染色反應(yīng)與放線菌相同，但抗酸染色為弱抗酸性，可報(bào)告找到疑似奴卡菌。4．厭氧菌涂片檢查：涂片染色同一般細(xì)菌，鏡檢時(shí)注意有芽孢的革蘭陽性桿菌可能是梭狀芽孢桿菌屬；如見芽孢部位菌體不膨大，排列呈竹節(jié)狀，要注意炭疽芽孢桿菌；兩端尖的革蘭陽性桿菌可能為梭狀芽孢桿菌；如為革蘭陰性無芽孢桿菌，伴痰有惡臭，可能有擬桿菌?？傊鶕?jù)細(xì)菌的著色、形態(tài)、排列做出初步診斷。(二)細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定1．一般要求：下呼吸道感染培養(yǎng)的細(xì)菌濃度應(yīng)≥107cfu/ml，可視為病原菌，＜104cfu/ml可視為污染菌。若介于兩者之間如105～106cfu/ml時(shí)，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為105～106cfu/ml時(shí)，也認(rèn)為是病原菌。2．痰培養(yǎng)標(biāo)本的前處理：一般是用無菌生理鹽水將痰洗滌3次，主要是洗去痰中的常居菌，然后向痰液中加入等量的(pH值7.6)1％胰酶溶液，放置37℃90分鐘，即可使痰3．普通細(xì)菌培養(yǎng)：將處理后的膿痰接種于血瓊脂、中國藍(lán)瓊脂平板、巧克力瓊脂平板上，分別放入普通和5％～10％CO2環(huán)境，35％18～24小時(shí)后觀察菌落特征并涂片行革蘭染色，根據(jù)菌體的形態(tài)、特點(diǎn)做出初步鑒定。4．結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)：培養(yǎng)前先對(duì)痰中的雜菌進(jìn)行處理后。將其接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)，一般第一周觀察2次，以后每周1次，觀察菌落出現(xiàn)的時(shí)間、形態(tài)，陽性結(jié)果隨時(shí)發(fā)出報(bào)告，陰性者65．嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)：將均質(zhì)化的標(biāo)本接種于血瓊脂、巧克力瓊脂和BCYE瓊脂平板上，置35℃5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)。若在上述培養(yǎng)基中24小時(shí)內(nèi)有細(xì)菌生長，此菌則不是軍團(tuán)菌。如在BCYE平板上486．厭氧菌培養(yǎng)：將采集的厭氧菌標(biāo)本接種于厭氧培養(yǎng)基，生長后將細(xì)菌進(jìn)行鑒定，發(fā)出報(bào)告。六、臨床意義痰及下呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)對(duì)于某些疾病的診斷具有很重要的意義。1．細(xì)菌性肺炎為下呼吸道感染最常見的類型，近年調(diào)查表明，原來由肺炎鏈球菌所致肺炎仍為常見，由流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、MRSA和革蘭陰性桿菌所致肺炎比例明顯上升，軍團(tuán)菌肺炎也引起了人們的重視。在醫(yī)院感染中，革蘭陰性桿菌占50％以上而成為主要病原體，一些條件致病菌和耐藥菌成為醫(yī)院內(nèi)肺炎的主要致病菌。2．真菌性肺炎是致病性真菌和條件致病性真菌所引起。目前以條件致病性真菌感染致病為主，并呈上升趨勢，常見菌以白色假絲酵母菌為主，毛霉菌、曲霉菌和隱球菌也常見。真菌性肺炎常合并其他多種細(xì)菌感染，患者常由于使用大量抗生素而發(fā)生雙重感染，病情嚴(yán)重，給治療帶來困難。七、呼吸道感染常見病原菌呼吸系統(tǒng)感染的患者，檢出病原菌機(jī)會(huì)相當(dāng)高，但是必須區(qū)分是病原菌還是上呼吸道的正常菌群，因?yàn)楫?dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，弱毒菌均可成為呼吸系統(tǒng)感染的重要病原菌，因此條件致病菌分離時(shí)尤應(yīng)注意。結(jié)核桿菌如從痰中檢出，即可認(rèn)為有臨床意義。關(guān)于病原菌的確定，一般認(rèn)為，經(jīng)過洗凈法處理的痰培養(yǎng)，結(jié)果比較可靠。此外，亦可反復(fù)幾次檢查，分析比較，如多次分離到同一致病性比較弱的細(xì)菌也應(yīng)考慮為病原菌。呼吸道常見病原菌如下。1．革蘭陽性菌：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、厭氧鏈球菌、結(jié)核分支桿菌、放線菌、奴卡菌、白喉棒狀桿菌、炭疽桿菌。2．革蘭陰性菌：卡他莫拉菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、其他腸桿菌科細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳鮑特菌、擬桿菌。3．其他。肺炎支原體、奮森螺旋體、肺炎衣原體、假絲酵母菌。第三節(jié)尿液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征有典型的尿路感染癥狀；肉眼膿尿或血尿；尿常規(guī)檢查表現(xiàn)為白細(xì)胞或亞硝酸鹽陽性；不明原因的發(fā)熱，無其他局部癥狀；留置導(dǎo)尿管的患者出現(xiàn)發(fā)熱；膀胱排空功能受損；泌尿系統(tǒng)疾病手術(shù)前。二、采集方法1．中段尿采集法：留取早晨清潔中段尿標(biāo)本。女性：采樣前用肥皂水清洗外陰部，再用0.1％高錳酸鉀溶液沖洗外陰部尿道口，滅菌紗布擦拭，用手指將陰唇分開排尿，棄去前段尿，留取中段尿10ml于無菌容器中，加蓋立即送檢。男性：翻轉(zhuǎn)包皮，用肥皂水清洗尿道口，后用清水沖洗，棄取前段尿，留取中段尿約5～10ml于無菌容器中，加蓋立即送檢。2．恥骨上膀胱穿刺：先對(duì)穿刺部位進(jìn)行皮膚消毒，然后使用無菌注射器直接從恥骨上穿人膀胱吸取尿液，主要用于厭氧菌培養(yǎng)或留取標(biāo)本困難的嬰兒尿標(biāo)本的采集。3．直接導(dǎo)尿法：按常規(guī)方法對(duì)會(huì)陰部進(jìn)行消毒后，用導(dǎo)尿管直接經(jīng)尿道插入膀胱，先讓尿流棄15ml再留取培養(yǎng)標(biāo)本。4．留置導(dǎo)尿管收集尿液：用75％的酒精消毒導(dǎo)管接口，用注射器穿刺導(dǎo)尿管抽取5～10ml尿液，置于無菌容器中送檢；或拔去閉式引流的集尿袋，75％的酒精消毒接口后棄去導(dǎo)尿管前段尿液，留無污染的膀胱內(nèi)尿液送檢。三、標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本采集后，應(yīng)立即送檢。膀胱穿刺做厭氧培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)避免接觸空氣，針頭插上滅菌橡皮塞，立即送檢。尿液如不能立即送檢者，則必須保存于4℃冰箱，時(shí)間不超過6四、注意事項(xiàng)1．采集尿液標(biāo)本應(yīng)在使用抗菌藥物之前進(jìn)行，防止藥物對(duì)細(xì)菌的抑菌作用。2．應(yīng)取清晨第一次尿液送檢。3．尿液采集應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止污染。4．采集時(shí)應(yīng)注意不要讓外陰消毒劑混入標(biāo)本，引起抑菌后果。5．對(duì)留置導(dǎo)尿者，不可從集尿袋的下端管口留取標(biāo)本。五、檢驗(yàn)方法(一)涂片法1．一般細(xì)菌涂片：以無菌操作取尿液10ml左右放入無菌試管中，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，棄去上清液，取沉渣涂片，進(jìn)行革蘭染色，如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性或革蘭陰性菌，可根據(jù)細(xì)菌的染色性和形態(tài)，作出初步報(bào)告。2．假絲酵母菌檢查：取尿液離心沉淀物置于清潔玻片上，加蓋玻片后用高倍鏡觀察，若沉渣太多，可滴加10％的NaOH，使沉渣溶解后再鏡檢，或制成涂片革蘭染色油鏡檢查，如發(fā)現(xiàn)革蘭陽性卵圓形芽生孢子或假菌絲，即可作出初步報(bào)告。3．淋病奈瑟菌檢查：取尿液沉淀物置于清潔玻片上，制成涂片，革蘭染色，油鏡檢查，如發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌，呈腎型，存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，即可作出初步報(bào)告。4．結(jié)核分支桿菌檢查：取尿液10ml左右經(jīng)3000r/min離心30分鐘，取沉渣涂片，進(jìn)行萋一納及潘本漢染色，若兩種涂片均查見紅色桿菌，即報(bào)告“找到結(jié)核分支桿菌”，如萋一納染色找到紅色桿菌，而潘本漢染色中未發(fā)現(xiàn)紅色桿菌，則為恥垢分支桿菌，也可用金胺“0”熒光法進(jìn)行染色后(二)培養(yǎng)檢查1．一般細(xì)菌培養(yǎng)：用無菌接種環(huán)取尿液接種于血瓊脂平板和麥康凱Macc(或中國藍(lán)EMB)平板上，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果，根據(jù)菌落形態(tài)特征及涂片鏡檢結(jié)果，選擇相應(yīng)方法作進(jìn)一步鑒定，如培養(yǎng)482．特殊細(xì)菌培養(yǎng)。(1)淋病奈瑟菌培養(yǎng)：尿標(biāo)本收到后立即接種于預(yù)溫35℃的巧克力瓊脂平板，置35℃5％～10％CO(2)結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)：將尿液接種于血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后無細(xì)菌生長，可將尿液3000r/min離心30分鐘后取沉淀物0.1ml(3)假絲酵母菌培養(yǎng)：將尿液接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃(4)厭氧菌培養(yǎng)：用穿刺尿進(jìn)行培養(yǎng)，接種厭氧血瓊脂平板，厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。(三)定量培養(yǎng)1．平板接種法：用定量加樣器取5ml尿液滴注在瓊脂平板上，用接種環(huán)涂抹均勻，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，生長的菌落數(shù)乘以200，即為每ml2．定量接種環(huán)法：用定量接種環(huán)蘸取尿液標(biāo)本(10μl)在血瓊脂平板上作均勻畫線接種，置35℃培養(yǎng)24小時(shí)，計(jì)數(shù)生長的菌落數(shù)乘以100，即為每ml尿中細(xì)菌數(shù)，若平板上菌落數(shù)超過1000個(gè)，則報(bào)告：菌落數(shù)＞105cfu/ml3．傾注平板法：取被檢尿液0.1ml，加入9.9ml無菌生理鹽水中充分混勻，取此液1ml放入直徑為9cm的無菌平皿內(nèi)，同時(shí)加入已融化并冷卻至50℃的瓊脂培養(yǎng)基與尿液混勻，凝固后置35℃培養(yǎng)24小時(shí)，計(jì)數(shù)生長菌落乘以100六、臨床意義尿液細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)對(duì)腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、前列腺等處的炎癥變化具有診斷價(jià)值，隨著抗生素的應(yīng)用，可通過藥敏試驗(yàn)幫助臨床醫(yī)師合理選擇抗菌藥物，減少因用藥不當(dāng)而造成的耐藥菌株的增加。目前一般認(rèn)為采取清潔中段尿，診斷泌尿道感染的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)是：菌落數(shù)＞105cfu/ml。但由于某些原因的影響：如使用過抗菌藥物、使用過利尿劑或尿頻、采尿時(shí)外陰消毒液混入尿中或病原菌生長營養(yǎng)要求較高，使細(xì)菌繁殖受抑制等原因，菌落數(shù)在105cfu/ml以下，也不能完全排除尿路感染。七、尿道感染常見病原菌引起尿道感染的常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、沙雷菌、變形桿菌、普羅威登斯菌屬等的菌種、陰道加德納菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬、淋病奈瑟菌。沙門菌、志賀菌較少見。2．革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、腸球菌、β-溶血鏈球菌(通常為B群、A群、D群)、厭氧鏈球菌、結(jié)核桿菌。3．其他細(xì)菌：假絲酵母菌。第四節(jié)膿液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征1．軟組織的急性化膿性炎癥：當(dāng)局部有紅、腫、熱、痛和功能障礙等典型癥狀時(shí)，可能存在化膿性感染，但局部癥狀隨病程的遲早、病變范圍、位置深淺而不同。如癤、癰、急性蜂窩織炎、丹毒等。2．化膿性疾病：如甲溝炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、化膿性骨髓炎、氣性壞疽、細(xì)菌性結(jié)膜炎、鼻竇炎、化膿性扁桃體炎、急性化膿性中耳炎、急性化膿性乳突炎、急性乳房炎、急性膽囊炎、急性梗阻性化膿性膽管炎、心包炎、結(jié)核性腹膜炎等。3．膿腫：扁桃體膿腫、咽部膿腫、咽旁膿腫、腦膿腫、肺膿腫、肝膿腫、膿胸、腹腔膿腫、腎皮質(zhì)化膿性感染、腎周圍炎和腎周膿腫、直腸肛管周圍膿腫。4．創(chuàng)傷感染：術(shù)后切口感染、導(dǎo)管感染、臍帶殘端感染。二、標(biāo)本采集1．開放性感染和已潰破的化膿灶：外傷性感染、癌腫潰破感染、臍帶殘端、外耳道分泌物等感染部位與體腔或外界相通，標(biāo)本采集前先用無菌生理鹽水沖洗表面污染菌，用無菌拭子采取膿液及病灶深部的分泌物，置無菌試管內(nèi)送檢。注意盡量取化膿組織與正常組織交界處的膿汁，因?yàn)槟撝行牡募?xì)菌大部分已死亡，交接處的活菌較多，會(huì)提高陽性率。開放病灶不能做厭氧培養(yǎng)。2．閉鎖膿腫：一般采用穿刺或手術(shù)引流的方法采取。采集前先用1％活力碘和75％的酒精消毒周圍皮膚后，用無菌注射器抽取膿液送檢；也可于切開排膿時(shí)用無菌注射器或棉拭子采樣。盛于無菌容器內(nèi)或厭氧運(yùn)送系統(tǒng)送檢。3．抽取液體：包括胸腔積液、腹腔積液、盆腔積液、關(guān)節(jié)腔積液、膽汁、心包積液等，首先消毒皮膚，然后在手術(shù)引流時(shí)或經(jīng)穿刺術(shù)抽取標(biāo)本，注入血培養(yǎng)瓶或無菌容器或厭氧運(yùn)送系統(tǒng)送檢。三、標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本盛于無菌容器內(nèi)或厭氧運(yùn)送系統(tǒng)，室溫下15分鐘內(nèi)送檢，最長不超過2小時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。四、注意事項(xiàng)1．盡可能在用藥前采集標(biāo)本。如患者在采集標(biāo)本前已用藥，請(qǐng)?jiān)跈z驗(yàn)申請(qǐng)單上注明，檢驗(yàn)人員可在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)拮抗物，以利于提高陽性檢出率。2．采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意膿汁及分泌物的性狀、顏色及氣味，為分離鑒定致病菌提供依據(jù)。3．疑有某種細(xì)菌感染，若該細(xì)菌對(duì)干燥敏感，用無菌棉拭子采集標(biāo)本后，應(yīng)立即放入液體培養(yǎng)基內(nèi)；或采標(biāo)本前先將無菌棉拭子沾少許肉湯以保持標(biāo)本濕度。4．不能立即送檢的標(biāo)本，應(yīng)放4℃5．深部膿腫常由包括厭氧菌在內(nèi)的混合細(xì)菌感染所致，采集標(biāo)本應(yīng)遵守厭氧菌感染標(biāo)本的采集原則。五、檢驗(yàn)方法(一)涂片檢查1．革蘭染色檢查：分泌物或膿液涂片可以為單一菌種，也可為混合菌種，應(yīng)注意是否有厭氧菌?？蓤?bào)告“找到革蘭陰(陽)性菌，形態(tài)可能為××菌”。2．抗酸染色檢查：有些感染可能是結(jié)核桿菌引起的，直接抗酸染色有助于初步診斷，此外有利于發(fā)現(xiàn)奴卡菌和放線菌。(二)細(xì)菌培養(yǎng)1．普通細(xì)菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種血平板上畫線分離，置35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果，如有菌落生長，根據(jù)涂片染色特點(diǎn)和菌落特征初步判斷細(xì)菌的類屬，然后再按其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。如培養(yǎng)48～722．厭氧菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種厭氧血瓊脂平板，厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。3．苛氧菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃4．結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種于血瓊脂平板上，35％培養(yǎng)18～24小時(shí)后無細(xì)菌生長，再將沉淀物接種在羅氏培養(yǎng)基上。5．真菌培養(yǎng)：取膿汁棉拭子或膿汁接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃6．以色列放線菌和星型奴卡菌培養(yǎng)：采取“硫磺樣顆粒”或膿腫液接種于硫乙醇酸鈉肉湯或深層葡萄糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基，置35℃厭氧培養(yǎng)，同時(shí)接種沙保弱葡萄糖瓊脂斜面，置22～28℃培養(yǎng)。經(jīng)過4天培養(yǎng)后，若在厭氧培養(yǎng)的葡萄糖肉湯瓊脂平板上有白色、粗糙、或結(jié)節(jié)狀的菌落，黏附于培養(yǎng)基上不易用接種環(huán)取下，且在鹽水中不易乳化，而在需氧培養(yǎng)的平板上無類似菌落生長時(shí)，可疑為以色列放線菌。如有奴卡菌生長，則在需氧培養(yǎng)的沙保弱培養(yǎng)基上出現(xiàn)光滑、不規(guī)則折疊或顆粒狀的菌落，具有黃色至橙黃色的顏色，取菌落作濕片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)精細(xì)分支狀菌絲，革蘭染色陽性，抗酸染色弱陽性的菌絲，可報(bào)告“有奴卡菌生長六、臨床意義所有創(chuàng)傷均可有細(xì)菌污染，但不一定發(fā)生感染，細(xì)菌學(xué)檢查局部細(xì)菌的控制是有價(jià)值的。同時(shí)對(duì)導(dǎo)致傷口感染、膿腫形成的病原學(xué)診斷有重要意義。確定常居菌是否為創(chuàng)傷感染的病原菌時(shí)，要注意該菌是否在數(shù)量上占優(yōu)勢。目前臨床上區(qū)分創(chuàng)傷感染或污染，主要看細(xì)菌向活組織深部侵入程度及每克組織含細(xì)菌量是否達(dá)到定閾值。一般認(rèn)為每克組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在105～106個(gè)以上時(shí)即可造成傷口感染。淺部軟組織膿腫多由表皮葡萄球菌感染，而大的和嚴(yán)重的膿腫多由金黃色葡萄球菌感染引起，大腸埃希菌及乙型溶血性鏈球菌也可引起化膿性感染。由外傷性、血源性或鄰近組織病灶直接蔓延所致的急性化膿性骨關(guān)節(jié)炎常由金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌或傷寒沙門菌感染所致。慢性化膿性骨關(guān)節(jié)炎可由與急性期相同的病原菌引起，也可由結(jié)核分支桿菌引起，以結(jié)核分支桿菌引起的感染較常見?？赏ㄟ^涂片抗酸染色和分支桿菌培養(yǎng)確定病原學(xué)診斷，由金黃色葡萄球菌感染的骨髓炎的致病菌占80％～90％，乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、厭氧菌、大腸埃希菌和沙門菌的感染也有報(bào)道。由外傷性創(chuàng)傷引起的化膿性膽囊炎，幾乎都有細(xì)菌污染的可能，同時(shí)大多數(shù)會(huì)發(fā)生不同程度的感染，以葡萄球菌和鏈球菌多見。深部外傷和骨折，由于有塵埃或異物污染，極易發(fā)生破傷風(fēng)和氣性壞疽等厭氧菌感染。通過穿刺或手術(shù)采集膿液進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查可作出病原學(xué)診斷，也有利于臨床治療措施的制定。七、膿腫、傷口感染常見病原菌引起傷口、軟組織感染的常見病原菌。1．革蘭陰性菌：大腸埃希菌、克雷伯菌、腸桿菌、變形桿菌、假單胞菌屬、沙雷菌等陰性桿菌及卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌等陰性球菌。2．革蘭陽性菌：破傷風(fēng)芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、類白喉棒狀桿菌、結(jié)核分支桿菌等陽性桿菌及金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、四聯(lián)球菌、消化球菌、消化鏈球菌等陽性球菌。3．其他細(xì)菌：假絲酵母菌、以色列放線菌、星型奴卡菌等。第五節(jié)糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征當(dāng)腹瀉患者出現(xiàn)以下任何一種情況時(shí)建議采集糞便標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)：糞便涂片鏡檢白細(xì)胞≥5個(gè)/HP；重癥腹瀉；T＞38.二、標(biāo)本采集(一)標(biāo)本采集時(shí)間在發(fā)病早期和使用抗菌藥物治療前，不同時(shí)間采集2～3個(gè)標(biāo)本可以提高致病菌的檢出率。沙門菌感染，腸熱癥在2周以后；胃腸炎患者在急性期，早期采集新鮮糞便。(二)采集方法1．自然排便采集法：自然排便后，挑取有膿血、黏液部分的糞便1～3g，液狀糞便則取絮狀物1～3ml盛于無菌容器內(nèi)送檢。2．直腸拭子法：如不易獲得糞便時(shí)或排便困難的患者及幼兒，可用肥皂水將肛門周圍洗凈，用蘸有無菌生理鹽水的棉拭子插入肛門，成人約4～5cm，兒童約2～3三、標(biāo)本運(yùn)送1．糞便標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，室溫下不能超過2小時(shí)。2．直腸拭子采集的標(biāo)本必須放入送檢培養(yǎng)基或GN肉湯中送檢，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間不超過2小時(shí)。3．霍亂弧菌感染高度可疑標(biāo)本的運(yùn)送必須符合特殊標(biāo)本的安全要求。4．直腸活檢標(biāo)本容器內(nèi)盛少量無菌生理鹽水以防沉淀。四、注意事項(xiàng)1．雖糞便含有多種雜菌，但應(yīng)盡量采用無菌容器。2．為提高檢出率，要采集新鮮糞便作培養(yǎng)。3．腹瀉患者應(yīng)盡量在急性期采集標(biāo)本(3天)以內(nèi)，以提高陽性率。4．標(biāo)本最好在使用抗菌藥物前采集。5．用于厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)盡量避免與空氣接觸，最好在床邊接種。五、檢驗(yàn)方法(一)直接涂片檢查糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多，僅從細(xì)菌的染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌，只有少數(shù)細(xì)菌，如霍亂弧菌、結(jié)核分支桿菌、難辨梭菌、葡萄球菌以及假絲酵母菌才做直接涂片檢查。1．霍亂弧菌涂片檢查。(1)染色檢查：糞便通常為米泔樣，取新鮮標(biāo)本涂片2張，用乙醇或甲醇固定，分別作革蘭染色及1∶10稀釋的苯酚復(fù)紅染色，用油鏡檢查，觀察有無革蘭陰性，呈魚群樣排列的桿狀或弧形菌。(2)懸滴(壓滴)檢查：取糞便制成懸滴(壓滴)標(biāo)本，檢查細(xì)菌的動(dòng)力，霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型均呈穿梭狀運(yùn)動(dòng)。在懸滴涂片中加入O1群或O139群霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運(yùn)動(dòng)活潑的現(xiàn)象停止，為制動(dòng)試驗(yàn)陽性?？沙醪綀?bào)告為“疑似O1群霍亂弧菌”。申報(bào)上級(jí)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)作出處理，并做好患者消毒隔離工作。2．葡萄球菌涂片檢查：疑似葡萄球菌偽膜性腸炎患者，取水樣便或腸黏膜樣物涂片，革蘭染色后鏡檢，可見革蘭陰性桿菌明顯減少，有大量革蘭陽性球菌散在或成堆(葡萄狀)排列。3．難辨梭菌涂片檢查：取新鮮糞便涂片，革蘭染色后鏡檢可見革蘭陽性粗大桿菌，無莢膜，大多能形成卵圓形芽孢位于菌體一端，可初步報(bào)告為“找到革蘭陽性芽孢桿菌，疑似難辨梭菌”。4．結(jié)核分支桿菌涂片檢查：取蠶豆大小糞便與飽和生理鹽水10～15ml混合，靜置1～2小時(shí)，取浮面液體涂片作抗酸染色，若找到紅色桿菌可報(bào)告“找到抗酸桿菌”。5．空腸彎曲菌涂片檢查：將糞便涂片作革蘭染色，可見細(xì)小、長而彎曲的革蘭陰性弧形、S形、螺旋形、成海鷗狀的細(xì)菌，可作初步報(bào)告疑似彎曲菌。6．假絲酵母菌涂片檢查：將糞便制成壓滴標(biāo)本，高倍鏡觀察可發(fā)現(xiàn)光亮的卵圓形孢子或假菌絲。涂片革蘭染色可見革蘭陽性瓜子形狀的孢子或假菌絲。若僅見到孢子則報(bào)告找到革蘭陽性卵圓形芽生真菌孢子，同時(shí)還有假菌絲則可報(bào)告檢出假絲酵母菌。(二)培養(yǎng)檢查1．一般細(xì)菌培養(yǎng)：取糞便接種于血瓊脂平板，EMB(或MACC)瓊脂平板，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～242．特殊細(xì)菌培養(yǎng)。(1)霍亂弧菌。1)直接分離培養(yǎng)：將疑似霍亂弧菌感染的標(biāo)本除增菌外，同時(shí)接種慶大霉素平板(或TCBS平板)35℃培養(yǎng)16～18小時(shí)(增菌管6～82)增菌后分離培養(yǎng)：一般情況下將標(biāo)本直接接種堿性胨水增菌，于35℃培養(yǎng)6～8小時(shí)轉(zhuǎn)種慶大平板進(jìn)行分離鑒定，必要時(shí)可作2(2)副溶血弧菌：將標(biāo)本接種于副溶血弧菌增菌液中，同時(shí)接種血平板和TCBS平板，35℃培養(yǎng)18～24(3)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌：將標(biāo)本接種于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌培養(yǎng)基(NYE)中，22～25qC培養(yǎng)48小時(shí)。(4)艱難梭菌：將標(biāo)本立即接種CCFA(環(huán)絲氨酸一甲氧頭孢菌素一果糖瓊脂)平板上，或?qū)?biāo)本作10-6～10-2稀釋后定量分離培養(yǎng)，厭氧環(huán)境30～37℃培養(yǎng)48(5)空腸彎曲菌：接種于彎曲菌選擇培養(yǎng)基(camy-BA血瓊脂)；或接種CEM增菌液(經(jīng)42℃微需氧培養(yǎng)24～48小時(shí)后，再接種上述選擇培養(yǎng)基上)，在微需氧條件下培養(yǎng)，最好采用混合氣體(85％N2、10％CO2、5％O2)的方法，培養(yǎng)24～48(6)結(jié)核分支桿菌：將糞便標(biāo)本首先進(jìn)行培養(yǎng)前處理，然后接種羅氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)6～8(7)假絲酵母菌：將標(biāo)本接種于含氯霉素的沙保弱瓊脂和血瓊脂平板上置25～30℃和35℃培養(yǎng)24～3．菌群失調(diào)及菌群交替癥細(xì)菌培養(yǎng)：正常菌群失調(diào)培養(yǎng)，應(yīng)根據(jù)臨床提示選用多種培養(yǎng)基，包括強(qiáng)選擇和弱選擇性腸道菌培養(yǎng)基、需氧及厭氧血瓊脂平板、甘露醇食鹽瓊脂平板、Camp-BA平板、沙氏瓊脂平板等，將標(biāo)本接種上述各平板，分別孵育，22％、35℃、42六、臨床意義腸道病原菌能引起人類感染性腹瀉，致病菌能夠破壞宿主的防御系統(tǒng)，侵襲人體組織，其產(chǎn)生的毒素能引起食物中毒。長期應(yīng)用抗菌藥物能導(dǎo)致菌群紊亂而引起嚴(yán)重腹瀉，因此，糞便培養(yǎng)能為臨床及早作出診斷提供依據(jù)。七、腸道感染常見病原菌人類腸道中細(xì)菌繁多，種類亦多。在健康人腸道內(nèi)經(jīng)常寄居著大量的厭氧菌和小部分的兼性厭氧菌。腸道中細(xì)菌種類受食物的影響，除人乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內(nèi)以革蘭陽性菌為主外，其余的人腸道內(nèi)均以革蘭陰性菌占優(yōu)勢。這些細(xì)菌一般不引起疾病，一旦腸道發(fā)生病理改變時(shí)，就可能侵入病變部位引起疾病。常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：沙門菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、氣單胞菌、鄰單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華菌。2．革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌、難辨梭菌、腸球菌、厭氧鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。3．其他細(xì)菌：假絲酵母菌、結(jié)核分支桿菌。第六節(jié)腦脊液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢測一、采集指征1．成人：發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、頸強(qiáng)直和反射增強(qiáng)等癥狀，懷疑為腦膜炎的患者。2．兒童：因兒童和新生兒的臨床表現(xiàn)不明確和無特異性，因此對(duì)于嬰兒不明原因發(fā)熱，應(yīng)懷疑為腦膜炎，采集腦脊液。3．具有下列實(shí)驗(yàn)室檢查之一。(1)腦脊液的白細(xì)胞增加，蛋白質(zhì)升高，葡萄糖減少。(2)腦脊液革蘭染色發(fā)現(xiàn)微生物。(3)血培養(yǎng)陽性。(4)腦脊液、血液、尿液標(biāo)本對(duì)某種病原體抗原反應(yīng)呈陽性。(5)血清抗體滴度有意義的增加。二、采集方法用腰穿方法采集腦脊液3～5ml。患者應(yīng)先禁食，由醫(yī)師以無菌操作在患者第3和第4腰椎間隙或稍低處穿刺取得，小兒則于第4和第5腰椎間隙穿刺，裝入無菌試管，立即送檢。如果用于檢測細(xì)菌或病毒，腦脊液量應(yīng)≥1ml，如果用于檢測真菌或抗酸桿菌，腦脊液量應(yīng)≥2ml。三、標(biāo)本運(yùn)送1．如果用于檢測細(xì)菌，收集腦脊液后，在常溫下15分鐘內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。腦脊液標(biāo)本不可置冰箱保存，否則會(huì)使病原菌死亡，尤其是腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。2．如果用于檢測病毒，腦脊液標(biāo)本應(yīng)放置冰塊，在4℃15分鐘內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。用于檢測病毒的腦脊液，在4℃可保存四、注意事項(xiàng)1．最好在使用抗生素之前采集標(biāo)本。2．如果只采集到一管腦脊液而要做不同檢查，應(yīng)首先送到微生物室。3．采集腦脊液的試管不需要加入防腐劑。4．進(jìn)行腰穿過程中，嚴(yán)格無菌操作，避免污染。五、檢驗(yàn)方法(一)涂片法因腦脊液是無菌的，只要檢出細(xì)菌即可診斷感染的類型，所以直接涂片很重要。1．革蘭染色：肉眼觀察，混濁或膿性腦脊液可直接涂片。無色透明的腦脊液，首先3000r/min離心10～15分鐘，用沉淀物涂片，革蘭染色，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)，可初步提示感染細(xì)菌的種類。(1)檢查到革蘭陰性，凹面相對(duì)的球菌，細(xì)菌有時(shí)位于細(xì)胞內(nèi)，有時(shí)位于細(xì)胞外。此時(shí)可報(bào)告臨床“找到革蘭陰性雙球菌，位于細(xì)胞內(nèi)(外)，形似腦膜炎奈瑟菌”。(2)檢查到革蘭陽性，菌體周圍有明顯莢膜雙球菌，可報(bào)告“找到革蘭陽性雙球菌，形似肺炎鏈球菌”。(3)檢查到革蘭陰性，多形態(tài)、菌體大小不一，有桿狀或聳狀的細(xì)菌，可報(bào)告“找到革蘭陰性桿菌，形似流感嗜血桿菌”。(4)檢查到小的、規(guī)則的革蘭陽性桿菌，單獨(dú)或呈V形排列，出現(xiàn)于大量單核細(xì)胞之間者，可報(bào)告“找到革蘭陽性桿菌，形似產(chǎn)單核李斯特菌”。(5)檢查到革蘭陽性孢子或菌絲，可報(bào)告“找到真菌孢子或菌絲”。(6)檢查到上述以外的其他細(xì)菌，可報(bào)告“找到革蘭陽(陰)性球(桿)菌”。2．抗酸染色：4000r/min離心腦脊液30分鐘，取沉淀物作涂片，干燥、固定后，用萋納染色或金胺“0”3．墨汁染色：腦脊液離心3000r/min，10～15分鐘后，取沉淀物進(jìn)行墨汁染色，顯微鏡下可在黑色背景中，見到菌體周圍有透明莢膜，似一暈輪，有時(shí)出芽，可報(bào)告“找到新型隱球菌”。(二)PCR方法1．由于嬰幼兒較難采到腦脊液，對(duì)腦膜炎的診斷有較大困難，用PCR技術(shù)檢測外周血，對(duì)腦膜炎奈瑟菌感染者的陽性率為100％，且不受抗生素藥物治療的影響。2．由于結(jié)核桿菌在腦脊液中數(shù)量較少，因此抗酸染色和培養(yǎng)的陽性率很低，且培養(yǎng)時(shí)間長，用PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌DNA，檢出率高且快速，但要排除假陽性。(三)培養(yǎng)檢查1．一般細(xì)菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種于血瓊脂平板(BA)、巧克力平板(CA)、巰基乙酸肉湯，CA置5％～10％CO2環(huán)境中，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察有無細(xì)菌生長。如果無細(xì)菌生長，再轉(zhuǎn)種肉湯，繼續(xù)培養(yǎng)至722．特殊細(xì)菌培養(yǎng)。(1)結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種于血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～24(2)假絲酵母菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種沙保弱瓊脂平板上，25～30℃(3)厭氧菌培養(yǎng)：將腦脊液離心后的沉淀物接種厭氧血瓊脂平板和其他相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基，置厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。六、臨床意義正常人的腦脊液是無菌的。故在腦脊液中檢出細(xì)菌(排除標(biāo)本污染)，都應(yīng)看作是致病菌。由于引起腦膜炎的細(xì)菌種類不同，而治療、處理和預(yù)后均不相同，因此，必須經(jīng)涂片和培養(yǎng)檢查，以確定細(xì)菌的種別。此外，新型隱球菌和結(jié)核桿菌所致的腦膜炎，在臨床上常難以鑒別，更需經(jīng)細(xì)菌檢查加以區(qū)分。故腦脊液的細(xì)菌學(xué)檢查在臨床上具有十分重要的意義。七、腦脊液感染常見病原菌引起腦脊液感染的常見病原菌如下。1．革蘭陰性菌：腦膜炎奈瑟菌、卡他布蘭漢菌、大腸埃希菌、克雷