受精的細胞學觀察

受精的細胞學觀察受精（fertilization）是指精子和卵子相互結(jié)合而形成合子的過程。受精的生物學意義在于來自父母雙親的基因組結(jié)合，染色體由配子形成時的單倍體恢復到個體的二倍體，是一個新生命的開始。受精作用經(jīng)歷了精卵相互識別一精子入卵一雌雄原核融合等過程的一系列變化，包括精、卵在形態(tài)上和生理上的變化，如精子穿過卵膜時產(chǎn)生的頂體反應(yīng)；卵子被激動后的皮層反應(yīng);精子入卵后形成雄原核和卵母細胞完成第二次成熟分裂排出第二極體后形成雌原核；雌雄原核相互靠攏最后融合形成合子等等。對受精過程進行細胞學觀察是發(fā)育生物學的一個重要內(nèi)容。早期對馬蛔蟲卵的最后成熟和受精觀察成為經(jīng)典的實驗。后來對海膽的受精及受精機理研究，以及對哺乳類的精子“獲能”、體外受精等研究。隨著現(xiàn)代生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，對受精的生物學研究也越來越深入。本實驗將采用普通細胞學染色法觀察受精過程，同時學習魚類的人工催產(chǎn)和人工授精技術(shù)。一、實驗材料1、 實驗材料：性成熟的雌雄泥鰍（或其它）。2、 實驗器材：顯微鏡、解剖鏡、培養(yǎng)皿、注射器、玻缸、制作石蠟切片所需的常規(guī)儀器。3、 實驗藥品：Bataillon固定液：TOC\o"1-5"\h\z鉻酸（10%水溶液） 25ml苦味酸（飽和水溶液） 100ml冰醋酸 10ml此固定液最好在使用時配制，必須注意固定劑的含量與卵子的比例，每6ml固定劑固定10個卵子。番紅水溶液：番紅 1.5g苯胺水飽和液 100ml溶液過濾后即可使用。2%亮綠染色液：亮綠 2g95%酒精 100ml溶液過濾后使用。0.75%生理鹽水LRH-A、DOM催產(chǎn)激素制片所需的常規(guī)藥品。二、實驗技術(shù)1、 配子的獲得泥鰍為卵生、體外受精型硬骨魚類，一年中的大部分季節(jié)都可以獲得性腺發(fā)育成熟的雌、雄魚。在外型上雄魚的尾部上側(cè)表面上有一明顯突起的脊，雌魚則沒有，籍此可將雌雄魚分開。(1)人工催產(chǎn)：為了在實驗室內(nèi)按照所計劃的時間內(nèi)獲得未受精卵，必須對性腺已發(fā)育成熟的雌魚進行人工催產(chǎn)。催產(chǎn)的激素為LRH-A和DOM，催產(chǎn)劑量為每尾泥鰍(約20g)注射LRH-A2ug+DOM4ug。注射部位為雌魚的體腔或肌肉。將催產(chǎn)注射后的雌魚放入盛有井水的盆子中，沖氣待產(chǎn)。雄魚不必催產(chǎn)。(2)人工授精：泥鰍催產(chǎn)后，約經(jīng)過18-20小時，雌魚腹部明顯增大而且變得很松軟，雌魚即將產(chǎn)卵。此時輕壓雌魚腹部，從生殖孔流出的卵子一入水中即可散開，表明卵子發(fā)育已達適當成熟，即可進行人工授精。制備精液：將雄魚殺死，取出精巢置于培養(yǎng)皿中，吸取少量的生理鹽水于培養(yǎng)皿中，然后用粗鑷子搗碎精巢，釋放出精子。將成熟卵子擠入精液中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使卵子散開，1-2分鐘后用清水洗幾次，棄去精巢碎片，即完成授精。2、 受精細胞學的制片技術(shù)取材固定：分別在受精后(20°C)5min、10min、30min、45min直至第一次卵裂前的受精卵立即用Bataillon固定液固定24小時，然后流水中洗16-24小時。洗凈之后，倒去水分，在瓶中加上3ml的8%的碘酒精(在酒精中加碘片，至栗色為度)。一天以后，更換80%酒精保存，并進行石蠟包埋切片。切片和染色：按魚卵切片法進行脫水包埋并進行連續(xù)縱切片。切片厚度為7微米。貼片時切勿掉片！用番紅(safranin)和亮綠(lightgreen)染色。切片常規(guī)操作入水后在1.5%番紅水溶液中染色2-5min，稍經(jīng)蒸餾水洗滌后，即將片子浸入2%亮綠中1-2min，很快通過95%、100%的酒精洗去過多的染料同時除凈水份。然后入二甲苯中透明，最后用中性樹膠封片。在成功的片子上，染色體應(yīng)該是老紅色的，紡錘絲、星體和卵膜呈綠色，卵黃物質(zhì)呈淡紅色。三、實驗觀察鰍的卵呈圓球形，淡黃色且透明，直徑0.6-0.8mm。卵子為粘性，卵膜有初級卵膜和次級卵膜。卵膜上有卵膜孔（受精孔），精子從卵膜孔進入卵子。在卵子受精后，立即將受精卵置于顯微鏡下觀察受精膜和胚盤的形成過程。當精子接觸卵子時（雖然未必能看到精子的穿入），首先從精子入卵的部位隆起，接著向整個卵子周圍擴展，在1-2分鐘后受精膜完全和卵子表面分離。受精膜的隆起和卵子皮層顆粒的崩潰是連系在一起的，皮層顆粒位于卵子表層下面。受精膜開始是薄而軟，但在它隆起后不久經(jīng)歷著一個變硬的過程。與此同時，卵子的原生質(zhì)也大量地朝動物極的方向流動、集中，很快地在這里形成一透明的帽狀原生質(zhì)隆起，稱胚盤。未受精的卵子，由于受到某些理化因素的刺激，如水的激動，也有可能形成受精膜和胚盤突起，不過這種胚盤顯得不正常，不很透明。表面很快破裂，最終由于細胞質(zhì)的流散而崩潰。1、 精子入卵后5分鐘：當精子剛?cè)肼褧r，次級卵母細胞正處在第二次成熟分裂中期，仔細檢查切片，在精子入卵的地點（動物極）附近可以看到成熟分裂的紡錘體和已排出的第一極體。在卵子的邊緣分布著許多囊泡。精子入卵后不久，精子的頭部和中段經(jīng)過180。的轉(zhuǎn)動，然后頭部漸漸脹大，開始核化。中心體也從中段離開，在它的周圍形成一個較小的光芒狀結(jié)構(gòu)，稱為精子星體（spermaster）。與此同時，卵母細胞第二次成熟分裂紡錘體中的染色體已經(jīng)分為兩組，各向兩極移動，準備形成第二極體。2、 精子入卵后10分鐘：精子星體繼續(xù)擴大，同時精子的頭部更加脹大，并隨著星體遷移，有時能看到擴大的星體分成兩個子星體，這時卵母細胞已排出第二極體，第一極體也分裂為二。卵子邊緣的囊泡已較少，說明已排出。3、 精子入卵后30分鐘：精子的頭部繼續(xù)演變成泡狀結(jié)構(gòu)，最后變成雄性原核。卵母細胞核在完成第二次成熟分裂之后也轉(zhuǎn)變成雌性原核，它離開卵子的邊緣位置，隨著四周液體向心的流動而向下方移動，最后向精子星體所在的區(qū)域靠攏，終于與雄性原核緊緊地并列在兩個子星體之間，發(fā)生了兩性原核結(jié)合的現(xiàn)象。合子核正好位于胚盤的中央。這時卵