生物免疫分析技術(shù)

第四章生物免疫分析技術(shù)免疫學(xué)方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運(yùn)用，其中酶聯(lián)免疫吸附法〔ELISA〕曾經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛運(yùn)用，它可以用于測定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如如今人們所關(guān)注的食品平安性問題中一些物質(zhì)的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低本錢的優(yōu)點(diǎn)；可對大量的樣品進(jìn)展常規(guī)分析；可以用于樣品的定性挑選，也可以對樣品進(jìn)展定量測定以確定樣品中待測組分的含量。4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特異性、靈敏性在Ag，Ab反響中，用容易示蹤的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)志一種反響物，以了解反響能否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度〔即對未知成分的樣品進(jìn)展定性、定位及定量分析〕。4.2酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反響和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來。它具有免疫熒光實(shí)驗(yàn)和放射免疫實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，并抑制上述兩種方法的缺陷。酶標(biāo)志試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫實(shí)驗(yàn)，可直接肉眼察看也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結(jié)果比較客觀。酶免疫測定或免疫酶技術(shù)是指酶標(biāo)志抗體或酶標(biāo)志抗體進(jìn)展的抗原抗體反響。它主要包括兩個(gè)方面：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標(biāo)志，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學(xué)或電子顯微鏡察看細(xì)胞及亞細(xì)胞程度的抗原或抗體。酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保管其免疫活性，結(jié)合了作為標(biāo)志的酶催化作用。ELISA的根本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點(diǎn)ELISA的運(yùn)用實(shí)例ELISA4.2.1根本原理它采用抗原與抗體的特異反響將待測物與酶銜接，然后經(jīng)過酶與底物產(chǎn)生顏色反響，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體〔免疫吸附劑〕②酶標(biāo)志的抗原或抗體〔標(biāo)志物〕③酶作用的底物〔顯色劑〕丈量時(shí)，抗原〔抗體〕先結(jié)合在固相載體上，但仍保管其免疫活性，然后加一種抗體〔抗原〕與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物〔標(biāo)志物〕，此偶聯(lián)物仍保管其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原〔抗體〕反響結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化復(fù)原反響而呈顏色。顏色反響的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反響的深淺來定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡察看，也可以用分光光度計(jì)〔酶標(biāo)儀〕加以測定。

其方法簡單，方便迅速，特異性強(qiáng)。4.2.2酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下結(jié)合的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反響，還具有酶促反響，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反響。酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

4.2.3ELISA的種類和變化〔一〕雙抗體夾心法〔二〕間接法〔三〕競爭法〔四〕雙位點(diǎn)一步法〔五〕捕獲法測IgM抗體〔六〕運(yùn)用親和素和生物素的ELISA〔一〕雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原步驟：A將知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B參與待檢標(biāo)本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；C參與酶標(biāo)志特異性抗體，溫育后清洗；D參與酶作用底物，產(chǎn)生顯色反響，顏色的改動(dòng)與所加的待檢標(biāo)本溶液中的抗原量成正比。間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)志的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。〔二〕間接法步驟：A將知可溶性抗原吸附于載體〔聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠〕，經(jīng)溫育后清洗；B參與待檢稀釋血清，假設(shè)血清中有相應(yīng)特異性抗體存在那么與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；C參與酶標(biāo)志的抗球蛋白抗體，此時(shí)酶標(biāo)志抗抗體與吸附的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，溫育后清洗；D參與酶作用底物〔或稱基質(zhì)〕，酶分解底物并顯色，用光電比色計(jì)測定底物顯色深淺，即可推知抗體量?！踩掣偁幏ù朔捎糜跈z測小分子抗原。步驟：A將知抗體吸附于固相載體外表，溫育后清洗；B將能夠含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)志的知抗原溶液以適當(dāng)比例混合，參與已包被的載體孔中，溫育后清洗；C參與酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反響。色深表示結(jié)合的酶標(biāo)志抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)志的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)志抗原少，而待檢溶液中抗原量多。對看管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度那么隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，參與底物后顯色反響較弱。4.2.4特點(diǎn)特點(diǎn)一：靈敏性該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反響，產(chǎn)生可供察看的顯色反響景象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞程度上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克程度上對其進(jìn)展定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml程度，酶反響測定法的敏感度約為5～10μg/ml。特點(diǎn)二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合本質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決議簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反響具有高度的特異性。

例如乙肝病毒中的外表抗原〔HBsAg〕、e抗原〔HBeAg〕和中心抗體〔HBcAg〕，雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反響?？乖贵w反響的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物〔例如血清〕中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分別待檢物。ELISA運(yùn)用實(shí)例飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定〔主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素〕飼料中有害微生物的快速篩檢〔如沙門氏菌〕甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料平安檢測中的運(yùn)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松〔FN〕、甲氟磷酸異已酶〔SOMAN〕、草不綠〔Alachor〕、西維因〔Carbaryl〕、多菌靈及克菌丹〔Captan〕等。農(nóng)藥的檢測：ELISA檢測“非典型肺炎〞冠狀病毒ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的運(yùn)用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2〔hnRNPA2〕/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〔PtA〕33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體ELISA試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫井DNM-9602G酶標(biāo)分析儀DNM-9602標(biāo)配酶標(biāo)分析儀DNM-9602A酶標(biāo)分析儀幾種酶標(biāo)分析儀4.3放射免疫法放射免疫測定〔radioimmunoassay，RIA〕是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反響的特異性這兩大特點(diǎn)結(jié)合起來的免疫標(biāo)志測定技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、樣品用量少，而且不需求復(fù)雜的提純步驟。缺陷是需求特殊的儀器設(shè)備和一定的防護(hù)條件，而且有些同位素標(biāo)志物的半衰期較短以及實(shí)驗(yàn)廢物難以處置，對環(huán)境呵斥放射性污染。放射免疫測定法根本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標(biāo)志抗原對有限量抗體進(jìn)展競爭性結(jié)合的根底上。待測抗原是指人體內(nèi)某種微量活性物質(zhì)〔如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等〕，而標(biāo)志抗原使將知的上述物質(zhì)標(biāo)志上放射性同位素，具有示蹤作用。將標(biāo)志抗原〔Ag*〕和未標(biāo)志抗原〔Ag〕與特異性抗體〔Ab〕相混合，結(jié)果構(gòu)成標(biāo)志的和未標(biāo)志的抗原抗體復(fù)合物。標(biāo)志和未標(biāo)志的抗原競爭與抗體進(jìn)展結(jié)合的景象，成為競爭性抑制造用。Ag*+AbAg*-Ab標(biāo)志抗原特異性抗體標(biāo)志抗原抗體復(fù)合物+