細(xì)菌鑒定技術(shù)臨床微生物學(xué)和微生物學(xué)檢驗

細(xì)菌鑒定技術(shù)南華大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實(shí)驗教學(xué)中心教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學(xué)生實(shí)驗課時：4學(xué)時課程類型：專業(yè)實(shí)驗課課程要求：必修每組人數(shù)：2人實(shí)驗?zāi)康暮鸵笳莆砧b別細(xì)菌常用生化反響的原理和結(jié)果斷定。熟習(xí)鑒別細(xì)菌常用生化反響的培育基、方法和意義。熟習(xí)數(shù)字編碼鑒定技術(shù)的原理和結(jié)果判別。了解細(xì)菌數(shù)字編碼技術(shù)操作和臨床意義。實(shí)驗內(nèi)容生化反響培育基的制備。常用細(xì)菌生化反響。數(shù)字編碼鑒定。一、生化反響培育基的制備不同生化反響需選擇不同生化反響培育基。按相應(yīng)培育基配方及配制要求，制備所需生化反響培育基。制備方法同培育基制備技術(shù)二、常用細(xì)菌生化反響糖發(fā)酵實(shí)驗吲哚實(shí)驗〔靛基質(zhì)實(shí)驗〕甲基紅實(shí)驗V-P〔Voges-Proskauer〕實(shí)驗枸櫞酸鹽〔或檸檬酸鹽〕利用實(shí)驗克氏雙糖鐵〔KIA〕復(fù)合實(shí)驗動力、吲哚及脲酶〔MIU〕復(fù)合實(shí)驗1.糖發(fā)酵實(shí)驗【原理】：各種細(xì)菌含有不同的分解糖〔苷、醇〕的酶，對糖〔苷、醇〕分解才干也各不一樣，有的不分解，有的分解后僅產(chǎn)酸，有的分解后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，故可用來鑒別細(xì)菌。【方法】：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種葡萄糖、乳糖發(fā)酵管，35oC培育18-24h察看結(jié)果。1.糖發(fā)酵實(shí)驗【結(jié)果】：首先確定細(xì)菌能否生長，細(xì)菌生長者培育基呈混濁狀：1〕不分解糖，培育基顔色與接種前無變化，以“-〞表示；2〕分解糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培育基由紫色變?yōu)辄S色，以“+〞表示；3〕分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，除培育基顔色變化外，倒管中還有氣泡，以“⊕〞表示。2.吲哚實(shí)驗〔靛基質(zhì)實(shí)驗〕【原理】：有些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，與吲哚試劑構(gòu)成紅色化合物?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培育基中，35oC18-24h后，參與吲哚試劑數(shù)滴，靜置分層，察看結(jié)果?！窘Y(jié)果】：在培育物液面上層呈玫瑰紅色為陽性，不變色者為陰性。3.甲基紅實(shí)驗【原理】：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)，故培育基pH在4.5以下，參與甲基紅指示劑后呈紅色〔陽性〕；有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進(jìn)一步化為醇、酮等非酸性物質(zhì)，使培育基pH在6.2以上，參與甲基紅指示劑后呈黃色〔陰性〕?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種葡萄糖蛋白胨水培育基中，35oC18-24h，參與甲基紅指示劑2-3滴察看結(jié)果?！窘Y(jié)果】：紅色為陽性，黃色為陰性。－+4.V-P〔Voges-Proskauer〕實(shí)驗【原理】：某些細(xì)菌分解葡萄糖生成丙酮酸，進(jìn)一步脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰，后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色胍縮二乙酰，為VP實(shí)驗陽性。假設(shè)培育基中胍基含量少，參與少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反響?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，35oC，24-48h，參與VP試劑甲液和乙液各1滴，充分搖動，察看?！窘Y(jié)果】：紅色為陽性，假設(shè)為陰性應(yīng)再培育4h察看，仍無紅色者為陰性。－+5.枸櫞酸鹽〔或檸檬酸鹽〕利用實(shí)驗【原理】：當(dāng)細(xì)菌可以利用銨鹽作為獨(dú)一氮源，同時檸檬酸鹽為獨(dú)一碳源時，可在檸檬酸鹽培育基上生長，分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，使培育基變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，培育基不變色〔綠色〕為陰性。【方法】：大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于檸檬酸鹽培育基中，35oC，24-48h，察看?！窘Y(jié)果】：菌苔出現(xiàn)，培育基變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性。細(xì)菌不能生長，培育基不變色〔綠色〕為陰性。6.克氏雙糖鐵〔KIA〕復(fù)合實(shí)驗【原理】：該培育基用酚紅指示劑，在酸性時呈黃色，堿性時呈紅色。細(xì)菌如能發(fā)酵乳糖和葡萄糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，那么斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。如只發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，從而使斜面部分堅持原來的紅色；底層由于是在相對缺氧形狀下，細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖所生成的酸類物質(zhì)不被氧化揮發(fā)而堅持黃色。如細(xì)菌分解蛋白產(chǎn)生硫化氫，那么與硫化亞鐵作用生成黑色的硫化鐵，使培育基變黑。6.克氏雙糖鐵〔KIA〕復(fù)合實(shí)驗【方法】：將待檢菌接種于克氏雙糖鐵培育基〔底層穿刺，上層斜面劃線〕，35oC，24h，察看?！窘Y(jié)果】：發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，那么上層和底層均呈黃色且有氣泡產(chǎn)生；只發(fā)酵葡萄糖而不發(fā)酵乳糖，那么底層變黃，上層仍為紅色。如底層變黑，闡明該菌產(chǎn)生硫化氫，生成黑色的硫化鐵沉淀。雙糖鐵培育基規(guī)范管痢疾桿菌KA－－傷寒桿菌KA－＋大腸桿菌AA＋－7.動力、吲哚及脲酶〔MIU〕復(fù)合實(shí)驗【原理】：培育基為含尿素、蛋白胨的半固體培育基，指示劑為酚紅。具色氨酸酶的細(xì)菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，參與吲哚試劑后，培育基上層的吲哚會變紅；具脲酶的細(xì)菌能分解尿素產(chǎn)氨，使整個培育基變堿呈紅色；有動力的細(xì)菌沿穿刺線分散生長。【方法】：將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培育基，35oC，18-24h，察看動力和脲酶反響后，再滴加吲哚試劑?！窘Y(jié)果】：分散生長為動力陽性；滴加吲哚試劑后呈玫瑰紅色為陽性；培育基變紅脲酶陽性。大腸埃希菌MIU〔＋＋－〕三、數(shù)字編碼鑒定【原理】：數(shù)字編碼鑒定技術(shù)，是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個生化反響出現(xiàn)頻率總和。計算單項發(fā)生頻率和多項發(fā)頻率，得出鑒定百分率〔%id〕，按鑒定百分率排序、查碼。三、數(shù)字編碼鑒定【詳細(xì)內(nèi)容】：是將鑒別細(xì)菌的各種生化反響微量化與綜合系列化，將各種生化反響培育基分裝在微量板或微量