細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章

細(xì)胞生物學(xué)研討方法METHODSANDTECHNIQUES本章內(nèi)容提要第一節(jié)顯微技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞分別技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光〔或紫外線〕為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源?！?、光學(xué)顯微鏡1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械安裝2.原理：經(jīng)物鏡構(gòu)成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像?！惨弧称胀ü鈱W(xué)顯微鏡3.分辨力：指分辨物體最小間隔的才干。R=0.61λ/N．A．其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N．A．為鏡口率＝ｎsinα/2，n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角〔樣品對(duì)物鏡鏡口的張角〕。思索：如何提高顯微鏡的分辨才干？表一、幾種介質(zhì)的折射率顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：制造光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率普通為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X?！捕碂晒怙@微鏡Fluorescencemicroscope特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于察看能激發(fā)出熒光的構(gòu)造。用途：免疫熒光察看、基因定位、疾病診斷?！踩臣す夤簿劢箳呙栾@微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構(gòu)成立體圖像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/〔四〕暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因此視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的?？刹炜?~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種構(gòu)造間的對(duì)比度，使各種構(gòu)造變得明晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。環(huán)形光闌〔annulardiaphragm〕：位于光源與聚光器之間。相位板〔annularphaseplate〕：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ?！参濉诚嗖铒@微鏡原理用途：察看未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本〔六〕偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。光源前有偏振片〔起偏器〕，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器〔與起偏器方向垂直的偏振片〕。載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉〔七〕微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope〔DIC〕1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示構(gòu)造的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。〔八〕倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于察看培育的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光安裝?！簿拧钞?dāng)代顯微鏡的開(kāi)展趨勢(shì)采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影安裝于一體。自動(dòng)化與電子化。二、電子顯微鏡〔一〕透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。用于察看超微構(gòu)造〔ultrastructure〕，即小于0.2μm、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的構(gòu)造，又稱亞顯微構(gòu)造〔submicroscopicstructures〕。1.原理透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM表二、不同光線的波長(zhǎng)2、制樣技術(shù)1〕超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡察看的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)〔ultramicrotome〕制造。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬〔鈾、鉛〕鹽染色。2〕負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，枯燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料堆積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin3〕冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴顯露了斷面構(gòu)造。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜〔replica〕。AYeastCell20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)察看標(biāo)本外表構(gòu)造。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力〔區(qū)別熒光屏上間隔最近兩個(gè)光點(diǎn)的才干〕為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X?！捕硳呙桦娮语@微鏡Scanningelectronmicroscope〔SEM〕任務(wù)原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品外表激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品外表構(gòu)造有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器搜集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本外表發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。掃描電子顯微鏡原理人類紅細(xì)胞酵母人類精子〔三〕掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓〔2mV~2V〕，針尖與樣品之間構(gòu)成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的間隔有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子程度的凹凸形狀。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)〔固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)〕物質(zhì)均可進(jìn)展察看。掃描隧道顯微鏡原理STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)展細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)挪動(dòng)的機(jī)械安裝。顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人〔1962〕對(duì)非洲爪蟾進(jìn)展核移植獲得勝利。我國(guó)著名學(xué)者童第周等上個(gè)世紀(jì)70年代在魚(yú)類細(xì)胞核移植方面進(jìn)展了許多任務(wù)，并獲得了豐盛成果。顯微操作儀第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法〔histochemicalandcytochemicalstainingmethod〕用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)展定性和定位研討?！惨弧彻潭ㄎ锢砉潭ǎ貉た諝饪焖倏菰?、冷凍枯燥?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定?！捕筹@示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反響產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反響：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸〔Feulgen反響〕。聯(lián)苯胺反響：過(guò)氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反響：顯示蛋白質(zhì)。二、免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)展定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)志物有熒光素和酶。免疫熒光法〔immunofluorescenttechnique〕：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法〔enzyme-labeledantibodymethod〕：常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶，酶與底物發(fā)生反響后構(gòu)成不透明的堆積物，從而顯示出抗原存在的部位。三、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有本人特征性的吸收曲線?？衫蔑@微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)展定位、定性和定量測(cè)定。四、放射自顯影術(shù)用于研討標(biāo)志化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)志的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。普通用14C和3H標(biāo)志。常用3H-TDR來(lái)顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研討蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研討多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。五、分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，經(jīng)過(guò)氫鍵結(jié)合，構(gòu)成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間能否具有互補(bǔ)關(guān)系?！惨弧吃浑s交〔insituhybridization〕。用于檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是運(yùn)用帶放射性的DNA探針，后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)??！捕砈outhern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分別后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影，即可識(shí)別出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，那么稱為Northern雜交。六、PCR技術(shù)PCR即：polymerasechainreaction。反響體系：①樣品DNA；②引物〔primer〕，約15-20個(gè)核苷酸；③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus，最適作用溫度75~80℃，短時(shí)間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反響過(guò)程：①變性：約90-95℃；②復(fù)性：約60℃左右；③延伸：70-75℃；④反復(fù)“變性——復(fù)性——延伸〞過(guò)程20-30次循環(huán)。PCR原理第三節(jié)細(xì)胞分別技術(shù)一、離心技術(shù)是分別細(xì)胞器〔如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體〕及各種大分子根本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超越500Kg?！惨弧巢钏匐x心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分別大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過(guò)氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步經(jīng)過(guò)密度梯離心再行分別純化。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation〔二〕密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成一延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，經(jīng)過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分別。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1〕能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2〕PH中性或易調(diào)為中性；3〕濃度大時(shí)浸透壓不大；4〕對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。1、速度沉降velocitysedimentation用途：分別密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分別生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分別物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而到達(dá)分別。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分別密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分別組分的最大密度。所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，往往需求高速或超速離心。原理：樣品各成分在延續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心那么沉降到與本身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的成分分別。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)展快速定量分析與分選的一門(mén)技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，構(gòu)成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處置，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分別純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)〔flowcytometer〕。三、細(xì)胞電泳原理：在一定PH值下細(xì)胞外表帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)。各種細(xì)胞或處于不同生理形狀的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。用途：檢測(cè)細(xì)胞生理形狀和病理形狀、分別不同種類的細(xì)胞，如分別哺乳動(dòng)物的XY精子。第四節(jié)細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培育〔一〕動(dòng)物細(xì)胞培育群體培育〔massculture〕：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培育瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，集合〔confluence〕后構(gòu)成均勻的單細(xì)胞層；克隆培育〔clonalculture〕：培育高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。轉(zhuǎn)鼓培育法：為制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計(jì)，大容量旋轉(zhuǎn)培育，使培育的細(xì)胞一直處于懸浮形狀之中。原代培育〔primaryculture〕：即：培育直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個(gè)培育瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培育瓶稱為傳代或傳代培育〔Passage〕。細(xì)胞株〔cellstrain〕：從原代培育細(xì)胞群中挑選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系〔cellline〕：從腫瘤組織培育建立的細(xì)胞群或培育過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁衍?？寺　瞔lone〕：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。表三、實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacks

BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠Pt