大專生物化學(xué)專題一膠原蛋白的提取課件

專題一膠原蛋白的提取生物化學(xué)實(shí)用技術(shù)章宇寧2012.3膠原蛋白是一種極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動(dòng)物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%~30%，相當(dāng)于體重的6%至少有19種不同的類型膠原蛋白概述一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì)通常由3條多肽鏈組成，每條鏈都有左手螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈繞成右手超螺旋。螺旋區(qū)段之外的部分常發(fā)生各種交聯(lián)。每一條鏈都有若干個(gè)典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-)n。X、Y均表示任意的氨基酸,X通常是脯氨酸(Pro),Y通常指羥脯氨酸(Hyp)膠原蛋白中缺少Cys和Try膠原蛋白的組成與結(jié)構(gòu)制造食品止血，促進(jìn)傷口愈合作為可吸收的支架材料、縫合材料作為藥物載體局部整形膠原蛋白的應(yīng)用從膠原蛋白較為豐富的組織（例如皮膚和肌腱）中提取傳統(tǒng)來(lái)源：豬牛羊皮新興來(lái)源：魚(yú)鱗等問(wèn)題一：如何從原料中提取蛋白？問(wèn)題二：如何從蛋白中分離膠原蛋白？問(wèn)題三：如何檢驗(yàn)得到的蛋白是膠原蛋白？膠原蛋白的提取前處理粗分級(jí)（粗提）細(xì)分級(jí)（分離純化）問(wèn)題一：蛋白提取的步驟？作業(yè)一：某一特定蛋白質(zhì)分離提純的一般程序是什么？第一步：將蛋白與材料分開(kāi)，使其進(jìn)入溶液中酸溶堿溶鹽溶酶解粗分級(jí)注意根據(jù)所要提取的蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的粗分級(jí)方法提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.15~2mol/LNaCl)或是稀醋酸溶液。前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在2~3之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結(jié)合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質(zhì)量，取決于處理時(shí)間以及堿的濃度。酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水膠原蛋白提取的粗分級(jí)粗分級(jí)第二步：用簡(jiǎn)便且處理量大的方法去除無(wú)機(jī)物等雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液鹽析等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法超濾如蛋白相互差異較大，也可初步分離目標(biāo)蛋白

可逆沉淀鹽析法(中性鹽沉淀法)：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。有機(jī)溶劑沉淀法：常用與水互溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。

★蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零時(shí)，所處溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)最不穩(wěn)定，溶解度最小。超濾法利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對(duì)生物大分子溶液進(jìn)行過(guò)濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過(guò)濾出去，從而達(dá)到脫鹽或濃縮的目的。細(xì)分級(jí)進(jìn)一步分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)透析超濾凝膠過(guò)濾/層析/離子交換色譜密度梯度離心電泳等電聚焦在粗提膠原蛋白溶液中緩慢加入6mol/LNaOH至pH=7，冷凍離心去除沉淀，在上清液中加入NaCl攪拌，4℃保存過(guò)夜；離心取沉淀，用稀HAc溶解，將溶液裝入透析袋中，用0.1mol/L的Hac透析1天，再用蒸餾水透析1天。膠原蛋白的提純透析法電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中向電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶的電荷、等不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度各異，因而可聚集形成不同的條帶，從而達(dá)到分離的目的。

電泳法

電泳法膠原蛋白的電泳圖層析法：①離子交換層析法②凝膠過(guò)濾層析法③親和層析法④吸附層析法⑤分配層析法①離子交換層析法原理:根據(jù)離子交換劑與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換，再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即可達(dá)到分離具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的目的。②凝膠過(guò)濾層析法

(排阻層析，分子篩層析)原理：

混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內(nèi)部具有大量一定大小的微孔）的層析柱時(shí)，大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移動(dòng)較快，并最先被洗脫出來(lái)；小分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。③親合層析法親和蛋白配基原理：利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專一性配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合