實(shí)驗(yàn)一胰島學(xué)樣生長因子菌種的制備

實(shí)驗(yàn)一胰島素樣生長因子-1菌種的制備 (IGF-1)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵工業(yè)菌種的制備工藝和質(zhì)量控制，并為發(fā)酵實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備菌種。二、 實(shí)驗(yàn)原理菌種制備的主要手段是擴(kuò)培，其出發(fā)點(diǎn)就是盡可能培養(yǎng)出高活性能滿足大規(guī)模需要的純種。由于現(xiàn)代生產(chǎn)菌種的生產(chǎn)性能已非常高，因此，其自發(fā)突變往往以負(fù)向突變?yōu)橹?，加上平時(shí)操作中有可能污染，菌種很容易退化，所以菌種的管理非常重要，管理方式主要有兩點(diǎn)：一是分純，二是擴(kuò)培。分純是為了保證菌種的性能穩(wěn)定，一般每2個(gè)月左右就應(yīng)分純一次。菌種分享純化一般分兩步進(jìn)行。第一步是平板稀釋分離，目的是分離出單細(xì)胞菌落。具體方法是把待分離的菌株用無菌生理鹽水做成菌懸液，并在裝有玻璃珠的三角瓶中充分振蕩(可以放在搖床上振蕩20-30min)，利用玻璃的滾動(dòng)，使菌體細(xì)胞分散，然后將菌懸液稀釋成一定的濃度，分別作平板培養(yǎng)，使被分離的單細(xì)胞長成單菌落。第二步是挑若干單菌落移接于平板上，然后把這些菌株分別用三角瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。菌種擴(kuò)培的順序是：平板培養(yǎng)基菌種、一級(jí)種子、二級(jí)種子。.平板培養(yǎng)基菌種一般于37。。培養(yǎng)12h。每批菌種培養(yǎng)完成后，要仔細(xì)觀察菌落生長情況，菌落的顏色各邊緣等特征是否正常，有無感染雜菌的征象。對(duì)質(zhì)量有懷疑的應(yīng)堅(jiān)決不用。平板菌種應(yīng)保存于冰箱中。生產(chǎn)中使用的平板菌種不宜多次移接，一般只移接3次(3代)，以免由于菌種的自然變異而引起菌種退化。因此，有必要經(jīng)常進(jìn)行菌種的分離純化，不斷提供新的平板培養(yǎng)菌株供生產(chǎn)使用。.一級(jí)種子通常用試管進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)。一級(jí)種子的培養(yǎng)條件：每支試管中裝入5皿1液體培養(yǎng)基，瓶口用6-8層紗布包扎，0.1MPa的蒸汽壓力下滅菌30min，平板挑單菌落接種到試管培養(yǎng)基中。3.二級(jí)種子使用三角瓶培養(yǎng)。一般二級(jí)種子的數(shù)量是按發(fā)酵培養(yǎng)液體體積的1%來確定。近來由于發(fā)酵工藝的改進(jìn)，接種量有不斷加大的趨勢(shì)，甚至有達(dá)到10%的工藝。二級(jí)種子培養(yǎng)時(shí)間一般為3-4h種子培養(yǎng)成熟后，需要檢驗(yàn)其質(zhì)量。三實(shí)驗(yàn)器材：試管、三角瓶、高壓滅菌鍋、搖床。四實(shí)驗(yàn)步驟1平板培養(yǎng)基的制備將平板清洗干凈，晾干并且4個(gè)一組包扎好，放于高壓滅菌鍋中空消，空消條件為0.1Mpa20min配制LB固體培養(yǎng)基酵母粉5g/L蛋白胨10g/L氯化鈉5g/LpH7.2加入2%瓊脂粉在0.1Mpa20min滅菌后等溫度降到40度左右，培養(yǎng)基中加入80ug/ml卡那霉素。然后倒平板.將倒好的平板在37度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，檢查無菌后備用。將菌株采用接種環(huán)劃線到平板固體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。待用2一級(jí)種子的制備一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于制備大量高活性的菌體，其培養(yǎng)基配方同上(無瓊脂粉)將配好培養(yǎng)基分裝到150ml三角瓶中，高溫滅菌后，冷卻，挑在平板培養(yǎng)基上長出的單菌落，放于LB試管培養(yǎng)基中，在37度180r/min進(jìn)行培養(yǎng)，8-12h，待OD為0.8時(shí)，可轉(zhuǎn)二級(jí)種子。3二級(jí)種子的制備配方同上，0.1mpa20min滅菌后，冷卻后接種，接種量為2%-5%搖床培養(yǎng)3-4h實(shí)驗(yàn)二發(fā)酵罐的構(gòu)造及空消一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解發(fā)酵罐的罐體構(gòu)造和管道系統(tǒng)。.掌握對(duì)發(fā)酵罐及其管道系統(tǒng)的滅菌方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵罐由蒸汽管道、空氣管道、加料出料管道等組成，在實(shí)驗(yàn)之前，必須先對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行空消。微生物雖然是一個(gè)復(fù)雜的高分子體系。但受熱死亡是由于蛋白質(zhì)變性所致。在一定溫度下微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論。即微生物的死亡速率與任一瞬間殘存的活菌數(shù)成正比，這稱為對(duì)數(shù)殘留定律。三、 實(shí)驗(yàn)器材蒸汽發(fā)生器、發(fā)酵罐及控制系統(tǒng)、空氣壓縮機(jī)。四實(shí)驗(yàn)步驟思考題：畫出發(fā)酵罐的平面圖，并說明各個(gè)部件的作用。說明發(fā)酵罐的滅菌步驟？實(shí)驗(yàn)三IGF-1發(fā)酵及控制一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獍l(fā)酵罐的操作，完成IGF-1發(fā)酵的全過程操作。二、 實(shí)驗(yàn)原理本次實(shí)驗(yàn)涵蓋了發(fā)酵罐的實(shí)消、配料、接種及發(fā)酵控制等主要操作。（一） 發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌受許多因素的影響。培養(yǎng)基PH對(duì)微生物的耐熱性影響大，PH6.0-8.0時(shí)，微生物最耐熱，偏酸或偏堿使H+或HO-滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，促使其死亡；培養(yǎng)基成分也會(huì)影響滅菌效果，高濃度的有機(jī)物會(huì)在細(xì)胞周圍形成一層保護(hù)膜，影響熱的傳入，所以培養(yǎng)基中存在油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性，需將滅菌溫度升高或時(shí)間延長；對(duì)于含固形物多的培養(yǎng)基，滅菌溫度應(yīng)適應(yīng)提高，一般顆粒小于1mm時(shí)，對(duì)滅菌影響不大，但顆粒大時(shí)，雜菌包于其間難于被殺死，應(yīng)提高滅菌溫度或?qū)㈩w粒過濾除去。另外，含大量蛋白質(zhì)和淀粉的培養(yǎng)基容易起泡沫，泡沫中的空氣形成一隔熱層，使熱量難于穿透進(jìn)去，影響滅菌效果，因此應(yīng)加少量消泡劑以消除泡沫。在滅菌過程中，除微生物被殺死外，還伴隨關(guān)培養(yǎng)基成分的破壞，尤其是氨基酸、維生素、葡萄糖等成分，從而引起發(fā)酵產(chǎn)品的減產(chǎn)。隨著溫度的上升，菌死亡速率大于養(yǎng)分破壞速率。所以要達(dá)到相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時(shí)間，并可減少培養(yǎng)基養(yǎng)分的破壞程度。根據(jù)這一原理，目前常用高溫短時(shí)間來對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。（二） 滅菌方式本實(shí)驗(yàn)用分批滅菌，即將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后維持一段時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種進(jìn)行發(fā)酵，這種滅菌又叫實(shí)罐滅菌。特點(diǎn)是原料的滅菌和微生物的發(fā)酵在同一罐中進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)為①設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要要專門的滅菌設(shè)備②操作簡(jiǎn)單易行。缺點(diǎn)為①加熱和冷卻所需的時(shí)間長，降低了發(fā)酵罐的利用率，使生產(chǎn)周期延長；②無法采用高溫短時(shí)間的滅菌方法。適應(yīng)范圍是①規(guī)模較小的發(fā)酵罐；②起泡性強(qiáng)、黏度大和含固形物多的培養(yǎng)基。三實(shí)驗(yàn)器材蒸汽發(fā)生器、發(fā)酵罐及控制系統(tǒng)空氣壓縮機(jī)四實(shí)驗(yàn)步驟可參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書p88步驟但是培養(yǎng)基配方和實(shí)消操作步驟不一樣實(shí)驗(yàn)四發(fā)酵過程中間分析見發(fā)酵批報(bào)一、 殘?zhí)菣z測(cè)實(shí)驗(yàn)原理游離的寡糖和多糖中的已糖、戊糖及其糖醛酸經(jīng)濃硫酸脫水生成糖醛或羥甲基糖醛酸，生成物可與酚類化合物縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，已糖的生成物于490nm\、戊糖及糖醛酸的生成物在480nm波長處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系，用比色法可測(cè)定糖含量。二、 試驗(yàn)用品（一） 器材（1） 電爐（2） 水浴鍋（3） 722分光光度計(jì)。（二） 試劑（1） 75%、95%乙醇。濃硫酸：分析純，95.5%。（2） 80%苯酚：80g（分析純、重蒸餾試劑）加20ml蒸餾水使之溶解。可置冰箱中避光長期保存。（3） 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（4） 葡萄糖（或葡萄糖）標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱準(zhǔn)葡聚糖或經(jīng)干燥恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容到刻度，即含糖為100gg/mLo（三） 材料IGF-1發(fā)酵液。三、 實(shí)驗(yàn)程序（一）操作方法葡聚糖（或葡萄糖）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支塞試管，分別加入100gg/mL糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，各補(bǔ)加蒸餾水至1.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL,濃H2SO45.0mL,搖勻靜置10min后，在25-30°C水浴中放置20min，于490nm波長處測(cè)光吸收值，以1.0mL蒸餾水代替糖標(biāo)準(zhǔn)液，按同樣步驟操作為空白調(diào)零。以糖含量（pg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，