禽傳染性支氣管炎病毒s1基因與豬iggfc基因的克隆及在hela細(xì)胞中的融合表達(dá)課件

禽傳染性支氣管炎病毒S1基因與豬IgGFc基因的克隆及在Hela細(xì)胞中的融合表達(dá)

報(bào)告提綱背景綜述病原體：IBV〔單股正鏈RNA病毒，有囊膜〕流行病學(xué)：呼吸道排毒;飛沫傳播；潛伏期短；急性，高度接觸性；自然感染僅發(fā)生于雞,雛雞發(fā)病最為嚴(yán)重；低溫是發(fā)病的關(guān)鍵。臨床病癥：損害呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等；呼吸型、腎型、腺胃型等；檢測(cè)診斷：病毒別離、病毒中和、血凝抑制試驗(yàn)、RT－PCR；ELISA、AGP防治：預(yù)防為主〔環(huán)境＋疫苗〕，治療為輔禽傳染性支氣管炎(IB)

結(jié)合受體，誘導(dǎo)中和抗體、血抑抗體、CTL反響S蛋白E蛋白M蛋白N蛋白infectiousbronchitisvirusIBV參與病毒裝配〔與核衣殼相互作用，將其結(jié)合到囊膜〕具有大量抗原決定簇，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體

參與病毒粒子的釋放

IBV病毒粒子結(jié)構(gòu)背景綜述背景綜述S蛋白：裂解為S1(90kD)和S2(84kD)的兩個(gè)亞單位，均為糖蛋白。S1蛋白：由520～538個(gè)氨基酸組成。S1功能：別并結(jié)合宿主細(xì)胞膜上特異性糖蛋白受體參與膜融合氨基端參與決定毒株的組織親和性及毒力抑制多數(shù)中和抗體

IBVS1蛋白11737160N81269298C親水區(qū)疏水區(qū)強(qiáng)親水區(qū)S1蛋白(520-538AA)抗原決定簇背景綜述IgG水解:2Fab+Fc大小相近,活性不同F(xiàn)ab：結(jié)合抗原Fc：結(jié)合活化補(bǔ)體

哺乳動(dòng)物IgGFc段能與SPA、SPG非特異性結(jié)合;將目的基因與IgGFc基因融合表達(dá)，利于鑒定和純化！免疫球蛋白IgGFc段IgGFc目的及意義克隆豬IgGFc和IBVS1基因，為進(jìn)一步開發(fā)以這兩個(gè)基因?yàn)楦椎囊呙绾驮\斷方法做根底。表達(dá)S1-IgGFc，以IgGFc為蛋白標(biāo)簽，以期進(jìn)一步利用親合層析或免疫沉淀法，進(jìn)行IBV細(xì)胞受體的別離與鑒定。擴(kuò)取IBVS1基因擴(kuò)豬IgGFc基因融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞表達(dá)鑒定研究?jī)?nèi)容一.豬IgGFc基因的克隆和序列分析二.IBVS1基因的克隆和序列分析三.表達(dá)載體的構(gòu)建四.重組表達(dá)載體在Hela細(xì)胞上的表達(dá)結(jié)果與分析豬IgGFc基因擴(kuò)增一.豬IgGFc基因的克隆和序列分析擴(kuò)增區(qū)域：鉸鏈區(qū)——C末端不包括信號(hào)肽目的片段：1002bp上游：EcoRI位點(diǎn)下游：XhoI位點(diǎn)

豬IgGFc基因的RT-PCR擴(kuò)增pMD18T－IgGFc構(gòu)建圖pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切鑒定:EcoRI+XhoI陽性：2680bp+1002bp豬IgGFc基因的克隆和序列分析IgGFc序列分析測(cè)序結(jié)果：所獲序列(略)1002bp，與預(yù)期一致，無終止子，334個(gè)氨基酸Blast比對(duì)：100％gi5052049,gi47523191,

gi43312794%gi33125蛋白預(yù)測(cè)：分子量大小約37kD等電點(diǎn)為6.58在體內(nèi)半衰期約100h，不含跨膜區(qū)不含信號(hào)肽，與預(yù)期相符豬IgGFc基因的克隆和序列分析二.IBVS1基因的克隆和序列分析IBVS1基因的克隆S1基因PCR產(chǎn)物的電泳分析模板：含M41株S全長(zhǎng)的質(zhì)粒目的：19～536氨基酸上游BamHI，下游EcoRI去掉了信號(hào)肽保存裂解識(shí)別位點(diǎn)局部堿基，以增加空間距離pMD18T-S1構(gòu)建pMD18T-S1鑒定鑒定:BamHI+EcoRI預(yù)期:2680bp＋1554bppMD18T-S1BamHI+EcoRI酶切禽IBVS1基因的克隆和序列分析IBVS1序列分析測(cè)序：所獲序列〔略〕大小1554bp，與預(yù)期一致，無中止子，含518個(gè)氨基酸Blast：99％AY561712.1〔M41株S1基因〕蛋白預(yù)測(cè)：穩(wěn)定蛋白等電點(diǎn)8.17，分子量為58.9kD，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)半衰期超過30h不含跨膜區(qū)沒有信號(hào)肽禽IBVS1基因的克隆和序列分析三.載體構(gòu)建載體構(gòu)建流程圖順序選擇：S1位于上游S1功能區(qū)N端pcDNA3.1-IgGFc的構(gòu)建

pcDNA3.1-IgGFc雙酶切:XhoI+EcoRI預(yù)期帶:5.5kb＋1kb

pcDNA3.1-IgGFc經(jīng)XhoI＋EcoRI酶切表達(dá)載體的構(gòu)建pcDNA3.1-IgGFcS1的構(gòu)建BamHI+XhoI:5.5kb＋2.6kbNdeI酶切鑒定:800bp＋1600bp＋5600bppcDNA3.1-IgGFcS1/BamHI+XhoIpcDNA3.1-IgGFcS1/NdeⅠ表達(dá)載體的構(gòu)建四.重組載體在Hela細(xì)胞上的表達(dá)一抗：兔抗IBV陽性血清二抗：羊抗兔二抗熒光二抗結(jié)果：試驗(yàn)組觀察到特異性綠色熒光，對(duì)照組無綠熒光說明：IBVS1基因在Hela細(xì)胞中獲得了表達(dá)，且有活性

間接免疫熒光檢測(cè)IBVS1基因在Hela細(xì)胞上的表達(dá)IFA檢測(cè)IBVS1基因的表達(dá)直接檢測(cè)IgGFc的表達(dá)方法：直接免疫熒光二抗：羊抗豬二抗結(jié)果：試驗(yàn)組有較明顯的綠熒光，而對(duì)照組無。說明：IgGFc基因在Hela細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，且有活性直接免疫熒光檢測(cè)IgGFc基因在Hela細(xì)胞上的表達(dá)重組載體在Hela細(xì)胞上的表達(dá)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)

方法：Dot-blot〔直接和間接〕裂解液：都能檢測(cè)到強(qiáng)烈的陽性反響上清：檢測(cè)不到陽性反響說明：細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)物兼具IBVS1和IgGFc活性斑點(diǎn)雜交檢測(cè)IgGFcS1基因在Hela細(xì)胞上的融合表達(dá)A,B:為直接檢測(cè)結(jié)果C,D:間接檢測(cè)結(jié)果重組載體在Hela細(xì)胞上的表達(dá)小結(jié)通過RT-PCR從豬肝臟總RNA中擴(kuò)增到IgGFc基因，并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。PCR擴(kuò)增得到禽傳染性支氣管炎病毒S1基因進(jìn)行測(cè)序和序列分析。構(gòu)建了IBVS1基因和豬IgGFc基因融合表達(dá)的真核表達(dá)載體，并在Hela細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了其融合表達(dá)。經(jīng)檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞內(nèi)，且同時(shí)具有IBVS1活性和IgGFc活性。