神經(jīng)毒理學方法課件

神經(jīng)毒理學方法神經(jīng)毒理學是研究外源化學物對神經(jīng)系統(tǒng)各部分所引起的結構和功能損壞作用的一門學科。它主要應用神經(jīng)解剖、神經(jīng)病理、神經(jīng)生化、神經(jīng)藥理和分子生物學的學科的理論和技術，研究神經(jīng)毒物在機體內(nèi)的代謝、毒性效應發(fā)生的類型、特征、主要的臨床表現(xiàn)及其生化和分子機制，為中毒防止提供科學依據(jù)。神經(jīng)毒理學可看作既屬于毒理學分支,又深深扎根與神經(jīng)科學的一門交叉學科

任何一種方法和技術決定于它所要解決的問題，反過來，方法和技術的發(fā)展必然帶來某一學科的發(fā)展。鑒于神經(jīng)毒理學的特點，其研究方法必顯示此學科的特點，即神經(jīng)毒理學研究方法。方法和技術學科傳統(tǒng)毒理學研究方法1.體內(nèi)試驗：也稱為整體動物試驗。實驗多采用哺乳動物，常用8種：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其結果原則上可外推到人。2.體外試驗：利用游離器官、培養(yǎng)的細胞進行，多用于外源化學物對機體急性毒作用的初步篩檢、作用機制和代謝轉(zhuǎn)化過程的深入研究。體外試驗系統(tǒng)缺乏整體毒物動力學過程，并且難以研究慢性毒作用。3.人體觀察（急性中毒事故、受控的臨床實驗），可以直接獲得關于人體的毒理學資料，臨床毒理學主要研究僅限于低濃度、短時間的接觸，并且毒作用應有可逆性。4.流行病學研究：對人群的直接觀察中取得動物實驗所不能獲得的資料，優(yōu)點是接觸條件真實。但流行病學研究干擾因素多。神經(jīng)毒理學研究方法一、神經(jīng)行為功能評價方法二、神經(jīng)毒性評價方法三、行為發(fā)育毒性測試方法二、神經(jīng)行為功能測試組合1、FIOH測試組合（Finland‘sInstituteofOccupationalHealth,芬蘭職業(yè)衛(wèi)生研究所）測試組合2、WHO-NCTB測試組合WHO選定的神經(jīng)行為核心測試組合（neurobehavioralcoretestbattery,NCTB）3、NES方法神經(jīng)行為評價系統(tǒng)(neurobehavioralevaluationsystem)是1986年Lets和Baker提出的一組利用計算機進行測試的測試組合。三、學習和記憶功能測試（一）、人體試驗韋克斯勒記憶量表、韋克斯勒成人智力量表和臨床記憶量表主要用來測試人的認知和記憶的能力。（二）、動物試驗1、小鼠Y型迷宮實驗2、小鼠跳臺實驗3、小鼠避暗實驗4、大鼠穿梭實驗（雙向回避實驗）5、小鼠水迷宮實驗四、運動功能測試（一）、人體試驗手提轉(zhuǎn)速度試驗目標瞄準追擊試驗簡單反應時間試驗（二）、動物試驗活動度測定運動協(xié)調(diào)功能測試痛覺測定神經(jīng)毒性評價方法一、神經(jīng)病理學方法神經(jīng)病理形態(tài)或組織化學改變是確認神經(jīng)損害及其病變可逆性程度的重要手段，也是確認神經(jīng)毒性的最經(jīng)典方法。一般的研究思路，先進行肉眼觀察，并輔以腦的絕對和相對重量；其次，在光學顯微鏡下觀察基本病變，確定病變的腦區(qū)后，可進一步取材作電鏡檢查。為了確認神經(jīng)毒性的細胞特異性及某些特殊生化過程的影響，需用神經(jīng)系統(tǒng)組織化學等方法檢查。

▲可使用光鏡、電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、免疫組織化學、原位雜交法，受體定位法、熒光素示蹤技術和放射性核素示蹤技術對神經(jīng)系統(tǒng)進行形態(tài)學觀察和功能活動形態(tài)定位。如：1998年阮素云報道了低濃度鉛對大鼠血腦屏障超微結構的損害；2001年赫秋月報道了丙烯酰胺對小鼠小腦浦肯野細胞的病理改變；2003年楊芳報道不同濃度鋰對大鼠原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元的影響。二、生理與生物化學方法目前應用腦內(nèi)微透技術，微穿技術，磁共振光譜技術，高效液相色譜法，免疫印跡法，放射免疫分析法等測定神經(jīng)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量及其變化。如：2003年李紅玉報道了電磁輻射對大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響；胡衛(wèi)萱報道了甲基汞對腦組織有極大的親和性，2008年Yumi等發(fā)現(xiàn)組氨酸可減少腦水腫面積的增加

三、神經(jīng)電生理學方法神經(jīng)電生理學指標在實驗和人群的臨床研究中都得到了較為廣發(fā)的應用，可使用腦電圖，感覺誘發(fā)電位，肌電圖等測試神經(jīng)系統(tǒng)的電活動，離體的單個神經(jīng)細胞可用斑片鉗和膜片鉗技術評價單個細胞的單個離子通道及其受體的電活動。如：2002年阮迪云應用膜片鉗技術和原位雜交技術研究了鉛對鉀通道亞單位和NMDA受體亞單位的影響；2003年桑楠等報道了二氧化硫衍生物對大鼠海馬神經(jīng)元外向鉀電流特性的影響。四、分子生物學方法神經(jīng)生物學研究中常用的分子生物學方法有基因的分子克隆，克隆后的基因在人工體外系統(tǒng)或細胞中的表達，PCR擴增核酸分子技術，原位雜交技術，基因芯片等。如：2002年張增利報道了農(nóng)藥對小鼠腦細胞組織c-fos、c-jun、mRNA表達的影響；2002年逯曉波報道了鉛對幼鼠海馬區(qū)Bcl-2、Fas蛋白表達的影響；2004年丁曉蓉綜述了基因芯片與腦衰老的研究進展。五、腦成像技術腦成像技術很多，有顱骨X射線成像技術、同位素腦掃描、計算機斷層掃描、核磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描術及單光子發(fā)射計算機斷層攝影等。如1997年姜鋒杰報道了慢性錳中毒顱腦CT的改變，為錳中毒的診斷提供了新的參考依據(jù)。行為發(fā)育毒性測試方法一、行為發(fā)育毒性測試組合二、行為發(fā)育毒性研究組合如：2005年胡前勝報道了宮內(nèi)鉛暴露對大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響，2009年李洪鈞報道了孕中期鉛暴露對嬰兒神經(jīng)行為發(fā)育影響的研究。可以說，神經(jīng)毒理學的研究方法很多，任何研究神經(jīng)科學的方法如神經(jīng)生物學、神經(jīng)生理學、神經(jīng)生化學、神經(jīng)病理學、神經(jīng)藥理學、分子神經(jīng)生物學等方法都適用于神經(jīng)毒理學。

雖說神經(jīng)毒理學的研究方法很多，但是這些方法是互為補充的，有些指標也只有在結合其他相關指標時才能很好地予以解釋，實際上，由于神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性，單一的指標是不可能全面評價神經(jīng)毒性，因此將不同指標組合起來進行成套實驗是神經(jīng)毒性評價的主要研究方向。此外，我個人認為神經(jīng)毒理學研究方法還可根據(jù)試驗的樣本來源分為：一、人體研究二、動物實驗三、離體組織或細胞實驗就人體研究而言，其研究方法與動物實驗，離體實驗有明顯的不同，除了對一些特殊的志愿者研究外，所有的神經(jīng)毒效應不能采用人體進行研究。只能在接觸某些神經(jīng)毒物或中毒后進行某些神經(jīng)系統(tǒng)功能的臨床觀察和檢測；測定外周血、尿等替代指標，作為評價接觸神經(jīng)毒物的生物標志物；死后的組織病理學檢查。動物實驗和離體實驗的研究和應用應遵守優(yōu)化、減少及替代（refinement、reduction、replacement）3R原則。動物實驗：需要建立神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷的 動物模型。然后可以應用生理、 生化和分子生物學的方法檢測。此外，轉(zhuǎn)基因或基因剔除動物的實驗為從基因水平研究毒作用的種屬差異提供了可能。離體實驗最常見的辦法是從動物體分離得到的神經(jīng)細胞，在盡量模擬體內(nèi)環(huán)境的體外條件下，使神經(jīng)細胞仍保持存活、增殖、發(fā)