熒光化學(xué)發(fā)光在植物分子生物學(xué)的應(yīng)用

熒光/化學(xué)發(fā)光在植物分子生物學(xué)的運用陳海旭博士Outline1、熒光技術(shù)2、化學(xué)發(fā)光技術(shù)1、熒光技術(shù)熒光技術(shù)的分類熒光強度時間分辨熒光熒光偏振熒光共振能量傳送均相時間分辨熒光1〕熒光強度〔FI〕S1innerorbitalouterorbitalnucleousExcitationSignalExEmSoEmissionSignalFI運用的優(yōu)勢靈敏度高，運用方便、平安可以靈敏地利用各種類型的熒光探針和熒光染料對目的物質(zhì)進展特異性標志，大大減少雜質(zhì)的信號干擾可以進展活細胞或活體檢測〔細胞毒性小〕可以進展多重專注性標志〔如藍色細胞核/紅色線粒體〕FI運用范圍生物大分子的定量分析核酸、蛋白質(zhì)酶活性分析糖甘酶、蛋白酶、脫氫酶、過氧化物酶鈣流檢測報告基因檢測〔GFP〕FI運用－核酸定量分析Picogreen熒光染料可以排除蛋白質(zhì)等的信號干擾〔用于檢測蛋白質(zhì)樣品中的微量核酸〕ArabidopsisChromatinDNA－ThePlantCell,1846–1858,2003(15)TobaccoRNA－ThePlantCell,2203–2217,2003(15)FI運用－糖苷酶活性分析b-D-glucosidase－>4-MUb-D-glucopyranosideb-D-fucosidase－>4-MUb-D-fucosideDecreasedGlucosidaseandFucosidaseActivityinnai1-1andnai1-2ArabidopsisMutants.(PlantCell,1536–1549,2004-16)FI運用－蛋白酶活性分析FractionationofSoybeanProteasesafterOxidativeStress.(H2O2treatedvs.control)(PlantCell,431–443,1999-11)Arginine-specificProtease－>Z-Gly-Gly-Arg-AMCFI運用的局限性背景熒光干擾微孔板的自發(fā)熒光細胞的內(nèi)源熒光2〕時間分辨熒光〔TRF〕ElapsedTimeIntensityExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmissionEuropiumEmissionLongDecayTime...------Measurement------利用時間特性到達超高靈敏度Europiumion鑭系元素鑭系元素螯合物時間分辨熒光素－鑭系元素螯合物孵育(結(jié)合)洗滌〔去除非結(jié)合〕

檢測缺陷：需洗滌；洗滌強度很難一致，結(jié)果反復(fù)性差。FI/TRF運用的局限性〔非均相技術(shù)〕

熒光偏振〔FP〕熒光共振能量轉(zhuǎn)移〔FRET〕均相時間分辨熒光〔HTRF〕均相技術(shù)的優(yōu)勢孵育(結(jié)合)

檢測優(yōu)點：無需洗滌；均一性、反復(fù)性好“Add,Mix,andRead〞3〕熒光偏振〔FP〕PolarizerAnalyzer偏振光熒光分子運動熒光分子靜止100%0%熒光偏振〔FP〕原理<100%>0%熒光偏振是一種丈量分子旋轉(zhuǎn)速率的技術(shù)。P=———— I||+I|_I||–I|_標志的配體(低偏振值〕目的分子與標志的配體結(jié)合〔高偏振值〕FP運用方式－偏振值與分子大小的關(guān)系FP運用的優(yōu)勢均相(無分別/洗滌〕，在溶液中丈量；可以實時檢測〔動力學(xué)檢測〕；快速，容易實現(xiàn)高通量丈量的是比值，結(jié)果與熒光基團的絕對濃度無關(guān)FP運用范圍受體－配體相互作用多肽－蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)—核酸結(jié)合酶活性分析淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶fragmentsAmylaseAmyloseFP運用－淀粉酶活性分析熒光標志的Amylose被分解成小片段(偏振值下降)淀粉酶會促進生物體內(nèi)淀粉粒的降解，進而產(chǎn)生更多的能量物質(zhì)，來呼應(yīng)某些環(huán)境刺激或促進種子萌生。FP運用的局限性使器具有較短壽命的熒光素〔如Fluorescein〕依賴于分子結(jié)合呵斥的分子體積的顯著改動LARGEmolecule4〕熒光共振能量傳送〔FRET〕BindingNOBinding均相檢測〔無分別和洗滌步驟〕實時延續(xù)地察看活細胞的動態(tài)變化FRET運用的優(yōu)勢FRET運用范圍酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶蛋白質(zhì)—核酸相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展現(xiàn)系統(tǒng)所挑選克隆的復(fù)證鈣流檢測、離子通道研討蛋白質(zhì)的構(gòu)造研討FRET運用－鈣流檢測以熒光蛋白為根底的Ca2+sensor供體：CFP受體：YFPGuardcell〔Arabidopsis〕胞漿鈣離子動態(tài)(PlantJ,1999-19,p735-747)FRET運用例如－鈣流檢測FRET運用－胞內(nèi)激酶活性分析Indicatorsforproteinphosphorylationinlivingcells知蛋白激酶特異性的底物構(gòu)造域磷酸化識別構(gòu)造域蛋白質(zhì)磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要標志FRET運用的局限性信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1---背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號供體：鑭系元素螯合物受體：XL6655〕均相時間分辨熒光〔HTRF〕PAPCExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensityHTRF運用的優(yōu)勢－靈敏度更高的FRETPYenergytransferAPCEuExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensity2、化學(xué)發(fā)光技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)的分類發(fā)光發(fā)光共振能量傳送1〕發(fā)光〔Lum〕SubstrateProduct+LightEnzyme優(yōu)勢：超高靈敏度Lum運用范圍鈣流檢測基因調(diào)控ATP檢測發(fā)光免疫分析發(fā)光運用－鈣流檢測水母發(fā)光蛋白AequorinCa++Kineticsoftheβ-glucan〔葡聚糖〕elicitor-inducedenhancementofthe[Ca2+]cytinsoybeancells.〔BiologicalProceduresOnline2002-4/1,p105-118〕發(fā)光運用例如－鈣流檢測發(fā)光運用－基因調(diào)控pSP-luc+(轉(zhuǎn)化擬南芥細胞)Culturedcellsshowdiurnalrhythms(Arabidopsis)(PlantCellPhysiol,2004-45/1,p57-67)CCA1的啟動子區(qū)域CCA1－在晝夜節(jié)律調(diào)理起中心作用的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)光運用例如－基因調(diào)控2〕發(fā)光共振能量傳送〔BRET〕Donor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=YFPBRET運用范圍蛋白組學(xué):蛋白-蛋白相互作用胞內(nèi)細胞器間的相互作用對酵母雙雜交結(jié)果的驗證受體研討:受體的同源和異源二聚體化受體應(yīng)對傳導(dǎo)途徑孤兒受體的挑選BRET運用例如－蛋白質(zhì)相互作用發(fā)光光譜〔關(guān)注530/480ratio〕COP1的二聚體化COP1-光形狀建成的關(guān)鍵抑制因子COP1蛋白突變體的二聚體化研討(PNAS,2004-101/17,p6798–6802)BRET運用例如－蛋白質(zhì)相互作用cytoplasmiclocalizationsignal(CLS)技術(shù)總結(jié)熒光技術(shù)利用熒光物質(zhì)進展特異性標志；特異性好，靈敏度高；特別適宜于細胞研討和分子間相互作用研討。發(fā)光技術(shù)靈敏度超高，特別適宜于基因表達和基