熒光化學(xué)發(fā)光在植物分子生物學(xué)的應(yīng)用

熒光/化學(xué)發(fā)光在植物分子生物學(xué)的運(yùn)用陳海旭博士Outline1、熒光技術(shù)2、化學(xué)發(fā)光技術(shù)1、熒光技術(shù)熒光技術(shù)的分類(lèi)熒光強(qiáng)度時(shí)間分辨熒光熒光偏振熒光共振能量傳送均相時(shí)間分辨熒光1〕熒光強(qiáng)度〔FI〕S1innerorbitalouterorbitalnucleousExcitationSignalExEmSoEmissionSignalFI運(yùn)用的優(yōu)勢(shì)靈敏度高，運(yùn)用方便、平安可以靈敏地利用各種類(lèi)型的熒光探針和熒光染料對(duì)目的物質(zhì)進(jìn)展特異性標(biāo)志，大大減少雜質(zhì)的信號(hào)干擾可以進(jìn)展活細(xì)胞或活體檢測(cè)〔細(xì)胞毒性小〕可以進(jìn)展多重專(zhuān)注性標(biāo)志〔如藍(lán)色細(xì)胞核/紅色線粒體〕FI運(yùn)用范圍生物大分子的定量分析核酸、蛋白質(zhì)酶活性分析糖甘酶、蛋白酶、脫氫酶、過(guò)氧化物酶鈣流檢測(cè)報(bào)告基因檢測(cè)〔GFP〕FI運(yùn)用－核酸定量分析Picogreen熒光染料可以排除蛋白質(zhì)等的信號(hào)干擾〔用于檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品中的微量核酸〕ArabidopsisChromatinDNA－ThePlantCell,1846–1858,2003(15)TobaccoRNA－ThePlantCell,2203–2217,2003(15)FI運(yùn)用－糖苷酶活性分析b-D-glucosidase－>4-MUb-D-glucopyranosideb-D-fucosidase－>4-MUb-D-fucosideDecreasedGlucosidaseandFucosidaseActivityinnai1-1andnai1-2ArabidopsisMutants.(PlantCell,1536–1549,2004-16)FI運(yùn)用－蛋白酶活性分析FractionationofSoybeanProteasesafterOxidativeStress.(H2O2treatedvs.control)(PlantCell,431–443,1999-11)Arginine-specificProtease－>Z-Gly-Gly-Arg-AMCFI運(yùn)用的局限性背景熒光干擾微孔板的自發(fā)熒光細(xì)胞的內(nèi)源熒光2〕時(shí)間分辨熒光〔TRF〕ElapsedTimeIntensityExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmissionEuropiumEmissionLongDecayTime...------Measurement------利用時(shí)間特性到達(dá)超高靈敏度Europiumion鑭系元素鑭系元素螯合物時(shí)間分辨熒光素－鑭系元素螯合物孵育(結(jié)合)洗滌〔去除非結(jié)合〕

檢測(cè)缺陷：需洗滌；洗滌強(qiáng)度很難一致，結(jié)果反復(fù)性差。FI/TRF運(yùn)用的局限性〔非均相技術(shù)〕

熒光偏振〔FP〕熒光共振能量轉(zhuǎn)移〔FRET〕均相時(shí)間分辨熒光〔HTRF〕均相技術(shù)的優(yōu)勢(shì)孵育(結(jié)合)

檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需洗滌；均一性、反復(fù)性好“Add,Mix,andRead〞3〕熒光偏振〔FP〕PolarizerAnalyzer偏振光熒光分子運(yùn)動(dòng)熒光分子靜止100%0%熒光偏振〔FP〕原理<100%>0%熒光偏振是一種丈量分子旋轉(zhuǎn)速率的技術(shù)。P=———— I||+I|_I||–I|_標(biāo)志的配體(低偏振值〕目的分子與標(biāo)志的配體結(jié)合〔高偏振值〕FP運(yùn)用方式－偏振值與分子大小的關(guān)系FP運(yùn)用的優(yōu)勢(shì)均相(無(wú)分別/洗滌〕，在溶液中丈量；可以實(shí)時(shí)檢測(cè)〔動(dòng)力學(xué)檢測(cè)〕；快速，容易實(shí)現(xiàn)高通量丈量的是比值，結(jié)果與熒光基團(tuán)的絕對(duì)濃度無(wú)關(guān)FP運(yùn)用范圍受體－配體相互作用多肽－蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)—核酸結(jié)合酶活性分析淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶fragmentsAmylaseAmyloseFP運(yùn)用－淀粉酶活性分析熒光標(biāo)志的Amylose被分解成小片段(偏振值下降)淀粉酶會(huì)促進(jìn)生物體內(nèi)淀粉粒的降解，進(jìn)而產(chǎn)生更多的能量物質(zhì)，來(lái)呼應(yīng)某些環(huán)境刺激或促進(jìn)種子萌生。FP運(yùn)用的局限性使器具有較短壽命的熒光素〔如Fluorescein〕依賴于分子結(jié)合呵斥的分子體積的顯著改動(dòng)LARGEmolecule4〕熒光共振能量傳送〔FRET〕BindingNOBinding均相檢測(cè)〔無(wú)分別和洗滌步驟〕實(shí)時(shí)延續(xù)地察看活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化FRET運(yùn)用的優(yōu)勢(shì)FRET運(yùn)用范圍酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶蛋白質(zhì)—核酸相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展現(xiàn)系統(tǒng)所挑選克隆的復(fù)證鈣流檢測(cè)、離子通道研討蛋白質(zhì)的構(gòu)造研討FRET運(yùn)用－鈣流檢測(cè)以熒光蛋白為根底的Ca2+sensor供體：CFP受體：YFPGuardcell〔Arabidopsis〕胞漿鈣離子動(dòng)態(tài)(PlantJ,1999-19,p735-747)FRET運(yùn)用例如－鈣流檢測(cè)FRET運(yùn)用－胞內(nèi)激酶活性分析Indicatorsforproteinphosphorylationinlivingcells知蛋白激酶特異性的底物構(gòu)造域磷酸化識(shí)別構(gòu)造域蛋白質(zhì)磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要標(biāo)志FRET運(yùn)用的局限性信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1---背景主要來(lái)自受體被直接激發(fā)的信號(hào)供體：鑭系元素螯合物受體：XL6655〕均相時(shí)間分辨熒光〔HTRF〕PAPCExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensityHTRF運(yùn)用的優(yōu)勢(shì)－靈敏度更高的FRETPYenergytransferAPCEuExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensity2、化學(xué)發(fā)光技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)的分類(lèi)發(fā)光發(fā)光共振能量傳送1〕發(fā)光〔Lum〕SubstrateProduct+LightEnzyme優(yōu)勢(shì)：超高靈敏度Lum運(yùn)用范圍鈣流檢測(cè)基因調(diào)控ATP檢測(cè)發(fā)光免疫分析發(fā)光運(yùn)用－鈣流檢測(cè)水母發(fā)光蛋白AequorinCa++Kineticsoftheβ-glucan〔葡聚糖〕elicitor-inducedenhancementofthe[Ca2+]cytinsoybeancells.〔BiologicalProceduresOnline2002-4/1,p105-118〕發(fā)光運(yùn)用例如－鈣流檢測(cè)發(fā)光運(yùn)用－基因調(diào)控pSP-luc+(轉(zhuǎn)化擬南芥細(xì)胞)Culturedcellsshowdiurnalrhythms(Arabidopsis)(PlantCellPhysiol,2004-45/1,p57-67)CCA1的啟動(dòng)子區(qū)域CCA1－在晝夜節(jié)律調(diào)理起中心作用的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)光運(yùn)用例如－基因調(diào)控2〕發(fā)光共振能量傳送〔BRET〕Donor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=YFPBRET運(yùn)用范圍蛋白組學(xué):蛋白-蛋白相互作用胞內(nèi)細(xì)胞器間的相互作用對(duì)酵母雙雜交結(jié)果的驗(yàn)證受體研討:受體的同源和異源二聚體化受體應(yīng)對(duì)傳導(dǎo)途徑孤兒受體的挑選BRET運(yùn)用例如－蛋白質(zhì)相互作用發(fā)光光譜〔關(guān)注530/480ratio〕COP1的二聚體化COP1-光形狀建成的關(guān)鍵抑制因子COP1蛋白突變體的二聚體化研討(PNAS,2004-101/17,p6798–6802)BRET運(yùn)用例如－蛋白質(zhì)相互作用cytoplasmiclocalizationsignal(CLS)技術(shù)總結(jié)熒光技術(shù)利用熒光物質(zhì)進(jìn)展特異性標(biāo)志；特異性好，靈敏度高；特別適宜于細(xì)胞研討和分子間相互作用研討。發(fā)光技術(shù)靈敏度超高，特別適宜于基因表達(dá)和基