科技論文文獻(xiàn)導(dǎo)讀-生物方面

編碼米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因

的克隆與重組表達(dá)

文獻(xiàn)閱讀——XXX目錄1、研究背景2、研究內(nèi)容3、實(shí)驗(yàn)結(jié)論4、存在問題21、研究背景低聚果糖引起人們的關(guān)注。米曲霉生產(chǎn)低聚果糖的能力被不斷開發(fā)出來。通過分子生物學(xué)手段，克隆果糖基轉(zhuǎn)移酶基因到不同的表達(dá)宿主中，以研究該基因的特點(diǎn)及在體外重組時(shí)異源蛋白的性質(zhì)。32、研究內(nèi)容(1)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆(2)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶原核重組表達(dá)(3)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的真核表達(dá)4(1)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆提取米曲霉總RNA合成米曲霉的cDNAPCR擴(kuò)增果糖基轉(zhuǎn)移酶基因基因的別離純化果糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆質(zhì)粒構(gòu)建〔pMD20-TVector〕5米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶克隆質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

6大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌轉(zhuǎn)化子篩選及驗(yàn)證

7(2)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶原核重組表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因擴(kuò)增果糖基轉(zhuǎn)移酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建〔pEASY-E1Vector〕大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖8大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)轉(zhuǎn)化子抗性篩選及驗(yàn)證重組果糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及結(jié)果檢測重組果糖基轉(zhuǎn)移酶純化及鑒定大腸桿菌表達(dá)重組子酶活力測定9(3)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的真核表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶真核表達(dá)載體構(gòu)建〔pPICZαB-SVector〕畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖10畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞制備重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母重組畢赤酵母抗性篩選及驗(yàn)證重組果糖基轉(zhuǎn)移酶在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定畢赤酵母表達(dá)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液酶活力檢測113、實(shí)驗(yàn)結(jié)論構(gòu)建不同的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因重組載體，得到帶有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的大腸桿菌菌體和畢赤酵母發(fā)酵上清液。比較兩株重組菌，大腸桿菌菌株生長速度快，蛋白表達(dá)量高。由于重組酶在胞內(nèi)表達(dá)，故可以大量收集菌體，制備粗酶液，進(jìn)行催化反響。而酵母重組菌株可以將重組酶分泌到發(fā)酵液中，大大降低了果糖基轉(zhuǎn)移酶純化的步驟和難度。12比照果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組表達(dá)，大腸桿菌重組菌的單位菌體酶活力要相對(duì)高于畢赤酵母單位發(fā)酵液酶活力。且兩者均低于根底菌株米曲霉菌絲體的果糖基轉(zhuǎn)移酶活力。134、存在問題

通過測序分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因片段與數(shù)據(jù)庫中提供的片段存在差異，引起了氨基酸變化，對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和功能的有沒有直接或間接的影響，還需要進(jìn)一步研究。14

在畢赤酵母誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)，加甲醇作為誘導(dǎo)劑，但是果糖基轉(zhuǎn)移酶作為一種食品工業(yè)的常用酶制劑，對(duì)甲