超詳細(xì)的真菌檢驗(yàn)學(xué)習(xí)筆記

超詳細(xì)的真菌檢驗(yàn)學(xué)習(xí)筆記

01

何為真菌？

基本特征

①真核細(xì)胞型微生物，屬于真菌界；

②具有典型細(xì)胞核，有完整的細(xì)胞器，不含葉綠素，不分

根、莖、葉；

③單核細(xì)胞或多核細(xì)胞組成的；

④細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和葡聚糖；

④以寄生或腐生的方式生存，能進(jìn)行有性生殖或(和)無(wú)

性生殖

⑤致病性：引起人類感染性、中毒性、變態(tài)反應(yīng)性疾病。

真菌的分類

(1)分類單位：

(2)按形態(tài)分：

①單細(xì)胞真菌：

酵母菌：如新生隱球菌，以出芽方式繁殖，不形成真假菌

絲；

酵母樣菌：如念珠菌屬，以出芽形成芽管，形成假菌絲。

②多細(xì)胞真菌：

由菌絲+泡子組成絲狀菌（霉菌）形成菌落為絲狀型，

如：曲霉、毛霉、青霉、皮膚癬菌等、各種霉菌的菌絲和泡子

形態(tài)不同，是鑒別真菌的重要標(biāo)志。

「菌絲」：呈管狀，長(zhǎng)度隨不同的生長(zhǎng)條件而異，是由成

熟抱子以出芽方式繁殖時(shí)形成的。在適宜的環(huán)境中由泡子長(zhǎng)出

芽管，并長(zhǎng)出分支而不斷生長(zhǎng)形成的或有一段菌絲細(xì)胞增長(zhǎng)而

形成，許多菌絲交織成團(tuán)，成為菌絲體。

A.按形態(tài)不同：

螺旋狀、球拍狀、結(jié)節(jié)狀、鹿角狀、梳妝、關(guān)節(jié)狀菌絲

等。

B.按結(jié)構(gòu)不同：

有隔菌絲：是由橫隔將管狀結(jié)構(gòu)的菌絲分隔成一連串多細(xì)

胞樣的絲狀體如霉菌、青霉和毛癬菌菌絲（大多致病菌為有隔

菌絲）。

無(wú)隔菌絲：無(wú)隔膜整條菌絲為單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)

細(xì)胞核，根霉和毛霉的菌絲。

C.根據(jù)菌絲生長(zhǎng)方式（功能）不同分：

營(yíng)養(yǎng)菌絲：伸入到培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲。

氣生菌絲：露出培養(yǎng)基表面、向空間生長(zhǎng)。

生殖菌絲：氣中菌絲可生產(chǎn)有性或無(wú)性匏子。

菌絲的結(jié)構(gòu)和組成是真菌形態(tài)的的一個(gè)重要的特征，這有

助于對(duì)真菌的鑒別。

「袍子」：是真菌的繁殖體，不同的真菌都有其特定的苑

子，其形態(tài)、大小表面紋飾和色澤等各不相同。

根據(jù)繁殖的方式分為兩種：

A.有性泡子：是經(jīng)過(guò)兩性細(xì)胞接合的繁殖方式，通常經(jīng)過(guò)

質(zhì)配、核配和減數(shù)分裂三個(gè)過(guò)程。如：泡子菌絲、皮炎芽生

菌、石膏樣小抱子菌等。

B.無(wú)性抱子（多為病原性真菌繁殖方式）

無(wú)性苑子按形態(tài)不同分：

①分生電子：真菌中最常見的一種。

大分生袍子：（多細(xì)胞性）其大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒定

真菌的重要依據(jù)。

體積較大，分隔成較多細(xì)胞，長(zhǎng)呈梭形，棍棒型，梨形

小分生抱子：（單細(xì)胞性）各種真菌都能產(chǎn)生小分生泡

子，鑒別意義不大。

體積小，單細(xì)胞性外壁薄，有球型，卵形，梨形以棍棒狀

等各種不同的形態(tài)及。

②葉狀抱子：菌絲內(nèi)細(xì)胞直接形成。

芽生電子：由細(xì)胞出芽生成，多數(shù)芽生匏子生長(zhǎng)到一定大

小即與母體脫離，若不脫離，形成菌絲狀，被稱為假菌絲。

關(guān)節(jié)抱子：菌絲生長(zhǎng)到一定階段后，出現(xiàn)很多橫膈膜，然

后從橫隔膜處斷裂形成矩形、筒形或短柱狀的袍子。多出現(xiàn)與

陳舊的培養(yǎng)物中。

厚膜袍子：菌絲或分支的頂端有少數(shù)細(xì)胞有菌絲內(nèi)胞質(zhì)濃

縮、薄壁增厚形成，是為了抵抗不良環(huán)境，真菌的一種休眠

體。環(huán)境適宜時(shí)又可出芽繁殖。

③泡子囊泡子：菌絲分支的頂端或泡囊梗膨大形成泡子

囊，內(nèi)含許多泡子，泡子成熟后則破囊而出。如毛霉、根霉等

形成的匏子囊泡子。

02

真菌檢驗(yàn)的基本技術(shù)

1.標(biāo)本直接鏡檢

?生理鹽水

?透明膠帶法

2.染色鏡檢法

?革蘭染色（為革蘭陽(yáng)性，為深紫紅色）

?墨汁染色法

?乳酸盼棉藍(lán)染色法

?熒光染色

?糖原染色（PAS）：真菌及組織內(nèi)的多糖多糖-紅色；核-

藍(lán)色；背景-淡綠色。

,銀染色法

?吉姆薩染色、瑞氏一吉姆薩染色法

?病理組織染色法

3.真菌培養(yǎng)及鑒定

（1）培養(yǎng)方法

?點(diǎn)植法

?劃線法

?直接培養(yǎng)與間接培養(yǎng)

?試管培養(yǎng)

?平板培養(yǎng)

?大培養(yǎng)

?小培養(yǎng)：玻片法、方塊法、小鋼圈法

(2)培養(yǎng)條件

?pH一般在5.0-7.0(大部分真菌適應(yīng)中性或偏酸環(huán)

境)；

?溫度：多25-28P,深部真菌一般37C；二相真菌26C

左右，為菌絲相，37℃,酵母相。

?滲透壓

(3)常用真菌培養(yǎng)基

4.培養(yǎng)真菌的菌落形態(tài)：

①酵母型菌落：(類似一般細(xì)菌菌落)菌落光滑、濕潤(rùn)、柔

軟、致密，似酵母。為單細(xì)胞真菌的菌落，以出芽方式繁殖，如

新型隱球菌顯微鏡檢可見圓形或橢圓形生芽細(xì)胞。

②類酵母型：外觀性狀同酵母型菌落，但除有生芽細(xì)胞外，

還有假菌絲伸入培養(yǎng)基中，是由伸長(zhǎng)的芽生袍子形成如白念珠

菌。

③絲狀菌落：菌絲疏松，呈棉絮狀、絨毛狀或粉末狀等，一

部分菌落向上生長(zhǎng)并形成泡子，一部分深入培養(yǎng)基下層。菌絲正

面和背面可顯示各種不同的顏色，常作為鑒定菌種的參考。

6.臨床標(biāo)本的真菌學(xué)檢查

(1)根據(jù)標(biāo)本類型分為：

①血液標(biāo)本

②骨髓標(biāo)本

③中心靜脈導(dǎo)管標(biāo)本

④腦脊液標(biāo)本

⑤痰、肺泡灌洗液、保護(hù)毛刷標(biāo)本

⑥分泌物標(biāo)本

⑦尿液標(biāo)本

⑧糞便標(biāo)本

(2)根據(jù)侵襲部位分：

皮膚黏膜感染性真菌：

①皮膚癬真菌

毛癬菌屬

表皮菌屬：只有絮狀表皮癬菌致病

小泡子菌屬

②表面感染真菌

③皮下組織感染真菌：引起頭癬、足癬、股癬、甲癬、體癬

引起侵襲性感染性真菌：

①酵母型真菌：念珠菌屬、隱球菌屬

②絲狀真菌：曲霉、毛霉、鐮刀菌屬

③卡氏肺泡菌

④二相性真菌：組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉、粗球皰子菌、

副球電子菌

「二相性真菌」：

二相性：有些真菌可因營(yíng)養(yǎng)、溫度、顏色等環(huán)境的改變，

二兩種形態(tài)發(fā)生互變。

二相性真菌：在體內(nèi)或體外含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基上37T培

養(yǎng)為酵母型真菌；在體外普通培養(yǎng)基上25T培養(yǎng)為霉菌型真

菌，如球匏子菌、組織胞漿菌、芽生菌和匏子絲菌、副球匏子

菌。

畫

實(shí)驗(yàn)室常見真菌

念珠菌屬

1.分類

念珠菌屬(Candida)(假絲酵母菌屬)生物學(xué)上屬于半知菌

亞門，該屬菌有150多個(gè)種，常見致病的有11種。

白念珠菌(Candidaalbicans)(白假絲酵母菌)為最常見的

致病菌。

白念珠菌(C.albicans)

熱帶念珠菌(C.tropicalis)

克柔念珠菌(C.krusei)

光滑念珠菌(C.glabrata)

季也蒙念珠菌(C.guilliermondi)

維斯念珠菌(C.viswanathii)

近平滑念珠菌(C.parapsilosis)

都柏林念珠菌(C.dublinniensis)

星形念珠菌(C.stellatoidea)

克菲念珠菌(C.kefyr)

2.臨床意義

?分布與自然界，通常存在與人的體表、口腔、上呼吸

道、腸道和陰道黏膜

?大多是人體正常菌群，感染可以是內(nèi)源性的，也可是

外源性的。

?可侵襲多個(gè)部位，引起淺部和全身性感染

白念

女性的念珠性陰道炎、外陰炎；男性念珠菌龜頭炎、包皮炎

體質(zhì)虛弱的嬰兒：鵝口瘡念珠性陰道炎、外陰炎、肺炎、膀

胱炎、腎盂腎炎和心內(nèi)膜炎

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白念珠菌病：腦膜炎、腦膜腦炎、腦膿腫等

熱帶

先天性免疫缺陷的致病菌，可引起皮膚、黏膜和內(nèi)臟念珠菌

病

克柔

引起系統(tǒng)性念珠菌病，特別是先天性免疫缺陷患者和大量接

受抗菌藥物治療的患者

光滑

人體一種腐生菌，可導(dǎo)致泌尿生殖道感染，也是新生兒的條

件致病菌

3.生物學(xué)性狀

①菌體圓形或卵圓形，革蘭陽(yáng)性，著色不均勻。

②以出芽繁殖，形成米色或灰色的酵母樣菌落，有時(shí)表面有

褶皺。

③組織內(nèi)：可見芽生泡子和假菌絲。

玉米粉培養(yǎng)基：假菌絲、厚膜袍子

墨汁染色：陰性--沒有莢膜

4.微生物檢查學(xué)

①直接鏡檢：一般用于淺部念珠菌的檢查，也可用于血、

尿、腦脊液、活檢組織等標(biāo)本的檢查。顯微鏡下觀察，呈圓形或

卵圓形的芽生匏子，假菌絲和菌絲。

克柔可見假菌絲成對(duì)分枝，有細(xì)長(zhǎng)的芽生電子；

光滑可見卵圓形芽生袍子，細(xì)胞尖端單芽，無(wú)真假菌絲不產(chǎn)

生厚膜泡子

②分離培養(yǎng)及鑒定：可接種于沙保弱、血平板等培養(yǎng)基。沙

保弱培養(yǎng)基，25℃或37T培養(yǎng)1-4天

白念珠菌：乳白色、奶油色、隆起、表面濕潤(rùn)、光滑類酵母

型菌落，鏡檢可見假菌絲和芽生泡子；

熱帶念珠菌：乳白色至奶油色、隆起、無(wú)光澤、或稍有光澤

的菌落；

克柔念珠菌：生長(zhǎng)快，菌落大，呈柔軟、乳白色至乳黃色菌

落。

光滑念珠菌：42T可生長(zhǎng)，25或37T培養(yǎng)3日，形成光

滑、濕潤(rùn)、隆起、白色和奶油色乳酪樣較小菌落。

5.念珠菌的鑒定方法

①芽管形成試驗(yàn)：待測(cè)菌加0.5?1ml人或動(dòng)物血清——鏡

檢（37℃水浴1.5-4h）

結(jié)果：絕大部分白假絲酵母菌可形成典型的放大鏡柄狀芽管

并非所有的白念珠菌都形成芽管，需要設(shè)陰（熱帶念珠菌）

陽(yáng)（白念珠菌）性對(duì)照。培養(yǎng)時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，熱帶念珠菌在血清

中培養(yǎng)6h或更久也可形成芽管。

②厚膜匏子形成試驗(yàn)：在玉米粉瓊脂上，25C-28C孵育24-

48h,念珠菌屬中僅白念珠菌產(chǎn)生厚壁抱子。

③氯化三苯基四氮嘎反應(yīng)

白念-不變色（淡紅）

熱帶-深紅色或紫色

其它一紅色

④商品化顯色培養(yǎng)基

原理：是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物

反應(yīng)顯色的原理。（顯色底物：由產(chǎn)色基因和微生物部分可代謝

物質(zhì)組成，在特異酶作用下，游離出的顯色基因顯示一定顏色，

觀察顏色）

翠綠色菌落為白念珠菌，

鐵藍(lán)色菌落為熱帶念珠菌，

淡粉紅色菌落為克柔念珠菌，

紫色菌落為光滑念珠菌

其它為白色

⑤G試驗(yàn)

G試驗(yàn)（1,3-B-D-葡聚糖）可特異性激活邕變形細(xì)胞裂解

物種的G因子，引起裂解物凝固）

G試驗(yàn)檢測(cè)的是真菌的細(xì)胞壁成分一一1,3-B-D-葡聚糖，

人體的吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液中含量

增高。

原理：

1,3-B-D-葡聚糖能特異性激活反應(yīng)主試劑中的G因子、凝

血酶原等，引起顯色基質(zhì)中酰胺鍵的斷裂，產(chǎn)生能在405nm下

的顯色物質(zhì)pNA,,引起吸光度的變化。進(jìn)行定量檢查。

臨床意義：

適用于除隱球菌和接合菌(毛霉菌)外的所有深部真菌感染

的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。以下情

況可出現(xiàn)假陽(yáng)性：

(1)使用纖維素膜進(jìn)行血透，標(biāo)本或患者暴露于紗布或其

他含有葡聚糖的材料；

(2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制

品；

(3)鏈球菌血癥；

(4)操作者處理標(biāo)本時(shí)存在污染。

⑥其他：抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)、核酸檢測(cè)

隱球菌屬

1.致病特點(diǎn)：一般為外源性感染，經(jīng)呼吸道侵入人體，可由

肺經(jīng)血傳播至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和關(guān)節(jié)。

防最易侵犯的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起慢性腦膜炎，出現(xiàn)腦膜

刺激癥狀。

的新生隱球菌病好發(fā)生于體質(zhì)虛弱，免疫力低下者。如白血

病、艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病等病人。

b莢膜多糖是新生隱球菌重要的致病物質(zhì)

2.生物學(xué)性狀

口圓形的酵母型菌，外周有莢膜，折光性強(qiáng)。

由一般染色法不著色，難以發(fā)現(xiàn)。

防非致病的隱球菌在37C不生長(zhǎng)，無(wú)莢膜

▲徐和平/攝

3.微生物檢驗(yàn)

(1)直接檢查

①墨汁負(fù)染色：

通常用于檢查腦脊液等涂片中的隱球菌，是涂片中檢查隱球

菌的首選方法

標(biāo)本中菌體較大，呈較大的球型，菌體周圍有肥厚的莢膜

②隱球菌英抗原的檢測(cè)：常見有乳膠凝集法、膠體免疫金層

析法、酶聯(lián)免疫吸附法等。

▲徐和平/攝

③PCR檢測(cè)

(2)分離培養(yǎng)

菌體常見出芽現(xiàn)象、在沙保弱和血平板上25C和37C均可

生長(zhǎng)。但30C生長(zhǎng)良好，菌落奶白色至棕黃色，粘稠、不透

明、邊緣完整。

(3)鑒定：

①尿素酶試驗(yàn)：

新型隱球菌（+）、白假絲酵母菌（-）

②糖同化及發(fā)酵試驗(yàn)：

新型隱球菌、淺白隱球菌等可同化纖維二糖、肌醇等，但均

不能發(fā)酵糖類。

③酚氧化酶試驗(yàn)：

接種左旋多巴-枸椽酸鐵和咖啡酸培養(yǎng)基，經(jīng)2-5天，新型

隱球菌呈棕黑色菌落。

曲霉菌

1.基本特征

的多數(shù)只發(fā)現(xiàn)了無(wú)性階段，

防條件致病菌，最常見的是煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉

斯可侵犯機(jī)體許多部位，尤其是呼吸系統(tǒng)和全身性曲霉病。

防呼吸系統(tǒng)曲霉菌病引起支氣管哮喘或肺部感染。

防全身性曲霉菌病原發(fā)病灶主要是肺，可隨血播散至腦、心

肌和腎等。

膏有些曲霉菌能產(chǎn)生毒素引起機(jī)體食物中毒，黃曲霉毒素，

雜色霉毒素有致癌作用。

2.生物學(xué)特征：

▲徐春暉/繪

組成：分生匏子頭和足細(xì)胞

分生匏子頭：分生梗莖、頂囊、瓶梗

?；⒎稚葑渔?/p>

殼細(xì)胞：厚壁，頂生或間生的囊狀細(xì)胞

▲徐和平/供

閉囊殼：有性生殖器官，壁薄，由一層或數(shù)層多角細(xì)胞構(gòu)

成

▲徐和平/攝

3.分離培養(yǎng)

?曲霉菌在沙保培養(yǎng)基上，室溫及37C?45℃均能生長(zhǎng)

?形成絨毛狀或絮狀菌落

?菌落開始為白色，隨著袍子的產(chǎn)生，不同菌種可呈現(xiàn)各種

不同的顏色

?多數(shù)菌種只有無(wú)性階段，少數(shù)菌種存在有性階段

煙曲霉

的菌落擴(kuò)延，藍(lán)綠色至煙綠色，背面無(wú)色或黃褐色，絨毛

狀，37~45攝氏度生長(zhǎng)良好。

的頂囊燒瓶狀：?jiǎn)螌悠抗?，布滿頂囊表面2/3；分生泡子頭

圓柱形；分生泡子梗無(wú)色或綠色、光滑，無(wú)閉囊殼。

切引起肺曲霉病

黃曲霉菌

▲徐和平/供

防菌落表面黃綠色，背面無(wú)色或微褐色，羊毛狀

"頂囊近球形；單層和/或雙層小梗，布滿頂囊表面；分生

抱子頭放射狀或圓柱狀。泡子梗黃綠色、粗糙

斷引起肺、外耳道曲霉病，甲癬

黑曲霉菌

的生長(zhǎng)迅速，菌落初為白色羊毛狀，后為黑色或黑褐色粗絨

狀，背面無(wú)色或略帶黑褐色

防頂囊近球形；單層和/或雙層瓶梗；分生電子頭球形放射

狀，褐色至黑色；泡子梗無(wú)色至褐色、光滑

防引起外耳道、肺和膿皮癥樣曲霉

其他霉菌

土曲霉菌落

雜色曲霉菌落

構(gòu)巢曲霉菌落

4.微生物檢驗(yàn)

(1)顯微鏡檢查

①透明膠帶法

可有效的保持菌落的生長(zhǎng)形態(tài)，便于觀察真菌的產(chǎn)泡子結(jié)構(gòu)

及著生方式和袍子的排列方式。制片的過(guò)程應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)

行，疑為二相真菌，除弛子絲菌外不可采用此法。

在顯微鏡下的特征性表現(xiàn)：

可見較多的分生袍子頭，頂端膨大形成頂囊，頂囊上有小

梗，小梗上有許多小分生電子，透明二叉分支形(分枝呈45。

角)

有隔菌絲

黃曲霉菌

煙曲霉菌

黑曲霉菌

②乳酸酚棉藍(lán)染色法

(2)抗原、抗體的檢測(cè)：

包括抗原、抗體及代謝產(chǎn)物檢測(cè)

防抗原檢測(cè)：抑制性ELISA患者血清中的曲霉菌抗原，如

GM試驗(yàn)

防抗體檢測(cè)：檢測(cè)患者血清中抗曲霉抗體，常用免疫擴(kuò)散，

對(duì)流免疫、ELISA、放射、間接熒光等

由代謝產(chǎn)物：G試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞壁成分1-3-B-D甘露聚糖

G試驗(yàn)檢+GM試驗(yàn)可提高曲霉的檢出率

GM試驗(yàn)(Galactomannan)

一一目前國(guó)際公認(rèn)的曲霉菌的診斷方法

GM試驗(yàn)檢測(cè)的是半乳甘露聚糖，主要適于侵襲性曲霉菌感

染的早期診斷。曲霉菌特有的細(xì)胞壁多糖成分是B(1-5)陜喃

半乳糖殘基，菌絲生長(zhǎng)時(shí)，半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋

放，是最早釋放的抗原。GM釋放量與菌量成正比，可以反映感

染程度。連續(xù)檢測(cè)GM可作為治療療效的監(jiān)測(cè)。在造血干細(xì)胞移

植患者中的診斷敏感性高。

一步法酶免夾心微孔板方法檢測(cè)人血清中的半乳甘露聚糖，

采用鼠EBA-2單克隆抗體，直接和曲霉菌半乳甘露聚糖結(jié)合。

將鼠EBA-2單克隆抗體微孔板并結(jié)合抗原，且檢測(cè)結(jié)合到

已激活微孔板(結(jié)合物試劑：過(guò)氧化物酶連接的單克隆抗體)上

的抗原。將已經(jīng)過(guò)加熱處理(以便去除免疫復(fù)合物和沉淀可能干

擾實(shí)驗(yàn)的血清蛋白質(zhì))的EDTA血清樣本加入孔中。孵育——洗

板加底物(顯藍(lán)色)加入酸溶液終止反應(yīng)(藍(lán)色變黃

色)——比色(450nm和620/630nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)(酶標(biāo)

儀)測(cè)定樣本和對(duì)照的吸光度(光密度))

4以下情況可出現(xiàn)假陽(yáng)性：

(1)使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他嘎巴坦；

(2)新生兒和兒童；

(3)血液透析；

(4)自身免疫性肝炎等；

(5)食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米

等。

射以下情況可出現(xiàn)假陰性：

(1)釋放入血循環(huán)中的曲霉GM(包括甘露聚糖)并不持續(xù)

存在而是會(huì)很快清除；

(2)以前使用了抗真菌藥物；

(3)病情不嚴(yán)重；

(4)非粒細(xì)胞缺乏的患

囤

案例分析

患者胡某，男，21歲，因“騎車摔傷致胸腹部、腰部疼痛4

小時(shí)”入院。

該病人基本特征如下：

1.患者為男性青年，既往體健。否認(rèn)“肝炎”、“結(jié)核”病

史，否認(rèn)“糖尿病”、“冠心病”病史，否認(rèn)食物、藥物過(guò)敏