化學品 嗜熱四膜蟲多代繁殖毒性試驗 征求意見稿

1GB/TXXXXX—XXXX化學品嗜熱四膜蟲多代繁殖毒性試驗本文件規(guī)定了化學品嗜熱四膜蟲（以下簡稱四膜蟲）多代繁殖毒性試驗的術(shù)語和定義、受試物信息、試驗原理、參比物質(zhì)、試驗系統(tǒng)、限度試驗、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)統(tǒng)計的要求。本文件適用于評價可溶性化學品對嗜熱四膜蟲多代繁殖的影響。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21845化學品水溶解度試驗GB/T21852化學品分配系數(shù)（正辛醇-水）高效液相色譜法試驗GB/T21853化學品分配系數(shù)（正辛醇-水）搖瓶法試驗GB/T21855化學品與pH有關的水解作用試驗GB/T27850化學品快速生物降解性通則GB/T21801化學品快速生物降解性呼吸計量法試驗GB/T21802化學品快速生物降解性改進的MITI試驗（I）GB/T21803化學品快速生物降解性DOC消減試驗GB/T21831化學品快速生物降解性密閉瓶法試驗GB/T21851化學品批平衡法檢測吸附/解吸附試驗GB/T21856化學品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗GB/T21857化學品快速生物降解性改進的OECD篩選試驗3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。種群密度populationdensity;PD單位體積（一般為mL）內(nèi)四膜蟲的個體數(shù)量。效應濃度effectconcentration;ECx在給定測定周期內(nèi)，與對照組相比，導致四膜蟲種群密度降低x%的受試物濃度。以每單位體積培養(yǎng)基所含的受試物量表示。最低可觀察效應濃度lowestobservedeffectconcentration;LOEC在給定測定周期內(nèi)，與對照組相比，在統(tǒng)計學意義上對四膜蟲種群密度產(chǎn)生顯著效應（P＜0.05）的最低受試物濃度。以每單位體積培養(yǎng)基所含的受試物量表示。2GB/TXXXXX—XXXXh)水解離常數(shù)(pka);生影響，因此短時間內(nèi)可完成化學品多代毒性的危害評價工作。將2×10?cells/mL種群密度的嗜熱四3GB/TXXXXX—XXXXc)超凈工作臺；d)全自動細胞計數(shù)儀(配備細胞計數(shù)板，測定體積為20μL);g)化學助溶劑(根據(jù)受試物溶解性選擇，如二甲基亞砜、乙醇、丙酮等);h)CellCountingKit-8(CCK-8試劑盒);k)巴氏吸管(3mL,5mL,10mL);1)玻璃錐形瓶(100mL,1000mL);m)玻璃燒杯(500mL);n)無菌細胞培養(yǎng)板(24孔、96孔);本文件推薦的受試生物為嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)SB210株系繁殖旺盛期的(即未出現(xiàn)平臺期降低、繁殖緩慢、尺寸減小等)四膜蟲。應在相同的環(huán)境條件(培養(yǎng)基、溫度、振搖速度和培養(yǎng)裝置)下進行培養(yǎng)。若是剛復蘇的四膜蟲，需要在胰蛋白胨(SPP)培養(yǎng)基中孵4GB/TXXXXX—XXXX對受試物進行稱重并溶解，可以通過超聲、攪拌、渦旋或其他適合的物理方法協(xié)助配制貯備液。儲備液的適宜濃度據(jù)受試物溶解度來確定，但一般不會超過1000μg/mL。低水溶性物質(zhì)的貯備液可以通過低毒的有機溶劑來助溶，例如二甲亞砜、乙醇、丙酮等。7.4.2試驗溶液的配置通過稀釋受試物貯備液配制成一定濃度的試驗溶液，推薦應用溶劑梯度稀釋的方法配置不少于5個受試物試驗濃度，以幾何級數(shù)分布，濃度間隔系數(shù)不超過3.2，并做好標記。貯備液和試驗溶液均用非培養(yǎng)基的溶劑進行配制，可在試驗開始前進行提前制備，建議即用即配。預試驗a）通過開展預試驗以確定正式試驗所需的受試物的濃度范圍，可選擇較大范圍的濃度梯度，如以1：10的高稀釋倍數(shù)選擇預試驗的試驗濃度。預實驗不設平行組，試驗時間為18h。試驗結(jié)束時統(tǒng)計各濃度的種群密度。根據(jù)預實驗的結(jié)果，再以較小的稀釋倍數(shù)進行正式試驗。b）如果一次預試驗結(jié)果無法確定正式試驗所需的濃度范圍，應調(diào)整受試物的濃度范圍，再次進行預試驗。正式試驗程序7.6.1試驗前的準備a）試驗開始前的18h-24h，用新配置的SPP培養(yǎng)基對生長狀況良好的四膜蟲進行傳代，接種密度為2.0×104cells/mL。傳代完成后放回30℃恒溫振蕩器中，中速振搖（135r/min）維持穩(wěn)定的生長和繁殖，并在暴露試驗開始前檢查其生長狀態(tài)。b）四膜蟲的繁殖模式十分規(guī)律，在上一次傳代時應根據(jù)試驗所需四膜蟲數(shù)量確定傳代體積，保證試驗所用四膜蟲數(shù)量滿足統(tǒng)計學要求。c）各濃度梯度的試驗溶液（非培養(yǎng)基溶解）均已配制完成，可直接用培養(yǎng)基進行稀釋。推薦一次試驗準備兩種或四種受試物的試驗溶液，即一次可進行2-4種受試物的毒性試驗。d）提前準備無菌離心管（推薦使用小容量離心管：200μL，500μL），并做好標記，用于試驗中的樣品采集以及四膜蟲的固定。7.6.2試驗周期試驗周期為18h。7.6.3接種與暴露a）用新鮮的SPP培養(yǎng)基將不同濃度的試驗溶液進行稀釋，同時準備溶劑對照試驗組培養(yǎng)基，即在培養(yǎng)基中加入等體積的純?nèi)軇：茉囄锏?組培養(yǎng)基和溶劑對照組培養(yǎng)基中的助溶劑終濃度應始終保持一致，并且不得超過100μL/L。當受試物水溶解度或在溶劑中的溶解度過低時，應增大試驗體系的體積(例如10mL-100mL)，不再使用24孔板作為試驗容器，改為使用三角瓶。此時不再使用貯備液稀釋的方法制備試驗溶液,直接使用SPP培養(yǎng)基在無菌條件下配制試驗溶液。b）測定四膜蟲初始種群密度后，用培養(yǎng)基將其制備成密度為2.0×104cells/mL的四膜蟲培養(yǎng)液，使用移液器將準備好的八組四膜蟲培養(yǎng)液均勻的依次加入24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1000μL，每個試驗濃度設置三個平行孔，應同時設置空白對照組，若使用助溶劑，還應增設助溶劑對照組。（推薦24孔板，暴露方案設置參見附錄C），此時計為0h。5GB/TXXXXX—XXXXc）如果條件允許，對照組平行數(shù)為處理組的2倍。如果試驗需要得出最低觀察效應濃度（LOEC）或無可觀察效應濃度（NOEC），可適當增加平行數(shù)（如設置6個平行）并相應增加24孔板的個d）接種完成后將蓋子放回原位，在培養(yǎng)板上標明接種時間和待測化學品名稱，用封口膜對孔板對角的兩角進行封口防止意外濺灑，重新置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)，保持在黑暗條件下，溫度設置7.6.4樣品采集7.6.4.1采集頻次本文件推薦1個采樣時間點，為暴露后18h。7.6.4.2采集程序a）暴露18h后，從恒溫振蕩器中取出培養(yǎng)板，將四膜蟲培養(yǎng)液輕柔的反復吹打混勻，從每孔各取140μL四膜蟲培養(yǎng)液于無菌離心管中。b）吸取20μL采集的均一四膜蟲培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入另一個提前加入20μL4%多聚甲醛的離心管中固定（四膜蟲培養(yǎng)液：4%多聚甲醛=1：1），用于種群密度的檢測。檢測應在每次采樣完成后立刻進行。7.6.5分析測定7.6.5.1受試物濃度測定試驗前需要對受試物在SPP培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性進行驗證；當受試物在暴露周期內(nèi)（18h）可維持在初始或理論濃度的±20%范圍內(nèi)，試驗結(jié)果使用理論濃度或初始濃度表示；當受試物在試驗過程中因生物降解、水解、氧化等原因而無法維持在初始或理論濃度的±20%范圍內(nèi)時，應測定空白對照組、助溶劑對照組和所有受試物試驗組在試驗開始和試驗結(jié)束時受試物的實際濃度，試驗結(jié)果以實測濃度的時間-加權(quán)平均值或幾何平均值表示。7.6.5.2四膜蟲種群密度檢測a）全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)法：撕去計數(shù)板上下兩層的保護膜，反復輕柔吹打以混勻固定的四膜蟲培養(yǎng)液，吸取20μL進行加樣。將需計數(shù)的一端插入進板口；選擇提前設置好的明場細胞計數(shù)Assay類型（Assay參數(shù)設置見附錄D），在主界面輸入樣品名稱和稀釋倍數(shù)；點擊主界面左下角“Preview”，預覽四膜蟲圖片，應符合細胞中心透亮，輪廓清晰且無聚團的要求。如不清晰，可適當調(diào)節(jié)焦距；拍攝圖片并自動采集種群密度數(shù)據(jù)。b）當毒性效應導致四膜蟲細胞密度過低時全自動細胞計數(shù)儀可能無法進行準確定量，此時建議使用細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行人工計數(shù)，統(tǒng)計每個網(wǎng)格內(nèi)的細胞數(shù)，最后計算出細胞密度。c）也可通過CCK-8試劑盒檢測四膜蟲的相對細胞活力，從而計算四膜蟲的種群密度。吸取100μL均勻的四膜蟲培養(yǎng)液加入至96孔細胞培養(yǎng)板中，并設置不含溶劑、受試物和四膜蟲的培養(yǎng)基作為對照組（推薦96孔板設置見附錄E）。每孔加入10μLCCK8試劑，將蓋子放回原位，用封口膜對孔板對角線的兩角進行封口以防止意外濺灑。30℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3h后，用多功能微孔酶標儀于450nm波長下檢測吸光度（OD值），以OD值和細胞密度作標準曲線，最后換算為四膜蟲的種群密度。8限度試驗6如果預試驗結(jié)果顯示，受試物在100mg/L的濃度下(或在試驗溶液中的最大溶解度下，該溶解度大于100mg/L)對四膜蟲沒有產(chǎn)生任何可觀察效應，可使用限度試驗，限度試驗的濃度為100mg/L,如果受試物在試驗溶液中的最大溶解度大于100mg/L,則取該最大溶解度作為限度試驗的濃度。限度試驗設9質(zhì)量控制9.1受試生物的質(zhì)量控制9.2檢測質(zhì)量控制(陽性對照組)來檢查試驗質(zhì)量。三氯卡班最大試驗濃度可設置為4mg/L,暴露18h后，三氯卡班對四膜蟲種群密度的EC??值在0.5mg/L-0.9mg/L范膜蟲種群密度的EC?值在0.05mg/L-0.09mg/L范圍內(nèi)；氯化汞最大試驗濃度可設置為4mg/L,暴露18以計算受試物暴露后24孔板中各孔種群密度的抑制率，用%表示，見式(1): P:處理組各平行四膜蟲的種群密度。若種群密度抑制率與受試物濃度呈劑量-效應關系，應采用適宜的數(shù)據(jù)(或經(jīng)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù))服從正態(tài)分布且方差齊性，采用多重t檢驗(multiplet-tests)統(tǒng)計學方法，7GB/TXXXXX—XXXX和NOEC。。如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差齊性時，則采用非參數(shù)檢驗方法，如Dunn’s檢驗或Bonferroni-U檢驗。當數(shù)據(jù)方差不齊但符合單變量劑量-效應關系時，可使用其他非參數(shù)檢驗（如Jonckheere-Terpstra趨勢檢驗或Shirley檢驗）。試驗報告試驗報告應至少包含以下內(nèi)容：a）受試物和參比物——單一組分受試物，化學名稱、IUPAC名稱或CAS名稱、CAS號、SMILES或InChI編碼、結(jié)構(gòu)式、水溶解度及相關的物理化學特性、純度、其它雜質(zhì)的信息和任何其它可獲得的信息（包括有機碳的含量，如適用）等；——多組分受試物，UVCB物質(zhì)和混合物：獲得盡可能多的各成分的組成比例和物理化學性質(zhì)；——用來鑒別和定量測試受試物的分析方法。b）受試生物——品系、分類名、代際信息、來源和培養(yǎng)條件。c）試驗條件——采用的試驗程序（接種密度、孔板信息等）；——培養(yǎng)溫度和振蕩器轉(zhuǎn)速信息；——試驗設計（試驗濃度及重復的數(shù)量等）；——受試物的預處理方法和添加回收率；——試驗濃度的理論值，濃度分析樣品的采集和獲得的濃度測定數(shù)值的詳細信息；——培養(yǎng)基的詳細信息（培養(yǎng)基的組分、PH等）。d）試驗結(jié)果——與受試物穩(wěn)定性相關的任何預試驗結(jié)果；——試驗結(jié)束時各組每個平行孔中四膜蟲的種群密度的完整記錄；——若適用，應報告受試物對四膜蟲種群密度的最低可觀察效應濃度（LOEC）和無可觀察效應濃度（NPEC包括采用的統(tǒng)計學方法的描述和預判毒性效應范圍的證據(jù)（為了證明這一點，在開始試驗前進行全面的分析）；若適用，四膜蟲種群密度的ECx和置信區(qū)間（如95%）和用于計算的合適模型曲線；濃度-效應方程和置信區(qū)間；——其它可觀察或測定的生物學效應：記錄任何其它可觀察或測定的生物學效應（如四膜蟲的異常行為；游動速率；形態(tài)變化等），并加以合理解釋。e）結(jié)果討論——可能影響結(jié)果的因素。f）解釋說明——對試驗中出現(xiàn)的任何偏離需說明偏離及對試驗結(jié)果的影響。8GB/TXXXXX—XXXX（資料性）四膜蟲時間-繁殖代際參考表在24孔板中，以2×104cells/mL的初始種群密度開始繁衍，四膜蟲種群數(shù)量和繁殖代際隨時間的變化參考表A.1。表A.1培養(yǎng)至不同時間點四膜蟲的種群數(shù)量和繁殖代際密度(×10cells/mL）99GB/TXXXXX—XXXX（規(guī)范性）四膜蟲的實驗室維護及培養(yǎng)方法實施指南B.1介紹嗜熱四膜蟲（TetrahymenaThermophila）是一種單細胞真核生物，分布在全球的淡水水域中。其外觀呈橢圓長梨狀，體長約50μm，全身布滿數(shù)百根長約4μm—6μm長的纖毛，纖毛排列成數(shù)十條縱列,以攝取水中的細菌與其他有機質(zhì)維生。在實驗室培養(yǎng)條件下，四膜蟲在培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)即可良好的生長，操作方便。它以二分裂的方式進行生殖，周期短，大約數(shù)小時可繁殖一代，在24h內(nèi)可完成約9-10代際的繁殖，培養(yǎng)過程中能夠迅速達到指數(shù)增長期，是生長最快的真核生物之一。相比于其他水生生物，嗜熱四膜蟲對水體中外源性污染物的毒性具有較高的敏感性，是探究水環(huán)境污染的理想指示生物。需要注意，為確保試驗結(jié)果的準確性，應在標準條件下進行四膜蟲的維護和培養(yǎng)。如使用的所有介質(zhì)均應使用超純水配置。所用玻璃器皿建議用手工清洗，清洗后用去離子水反復仔細沖洗，在干燥前應將玻璃器皿中的水倒排干凈。此外，為了防止污染，與四膜蟲接觸的所有物品均需提前進行滅菌處理，所有操作建議在無菌條件下完成。B.2常用培養(yǎng)基a）大豆培養(yǎng)基將1整粒黃豆（或鷹嘴豆）和10mL去離子水加入帶旋蓋培養(yǎng)試管中，高壓滅菌冷卻后加入青霉素和鏈霉素（250μg/mL）以及兩性霉素B（0.25μg/mL）。若培養(yǎng)基在24h內(nèi)出現(xiàn)渾濁或蒸發(fā)現(xiàn)象則不能使用。b）Tris緩沖液（10mmol/L）將1.22gTris溶解于1L去離子水中，高壓滅菌冷卻后，調(diào)節(jié)pH至7.5，4℃保存?zhèn)溆?。c）SPP培養(yǎng)基將10g蛋白胨、1g葡萄糖、0.5g酵母浸粉和0.015g鐵鈉鹽溶于1L去離子水中，經(jīng)121℃高壓滅菌30min，冷卻后加入青霉素和鏈霉素（250μg/mL）以及兩性霉素B（0.25μg/mL），調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.0，4℃保存?zhèn)溆谩.3四膜蟲的保種B.3.1四膜蟲的凍存四膜蟲的凍存操作步驟如下：a）四膜蟲的收集：收集處于對數(shù)生長期（種群密度范圍為1.5×105cells/mL-2×105cells/mL培養(yǎng)液）的四膜蟲培養(yǎng)液100mL，轉(zhuǎn)移至無菌的Tris緩沖液中室溫離心（3000r/min）2min，棄上清，再重復離心清洗一次后，用Tris緩沖液重懸至100mL。b）饑餓處理：將100mL四膜蟲培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至1L的無菌錐形瓶中（或兩個500mL錐形瓶，每瓶50mL四膜蟲培養(yǎng)液），封口后在30℃條件下靜止孵育2-3天。由于饑餓培養(yǎng)過程不進行振搖，因此選用大錐形瓶來保證充足的曝氣。c）凍存：將四膜蟲培養(yǎng)液在室溫條件下離心（3000r/min）2min后去除上清液，將原始體積（100mL）濃縮至1mL，并添加0.4mLDMSO（細胞級）和3.6mLTris緩沖液。輕柔吹打混勻四膜蟲懸液，分裝至多個凍存管中，每個凍存管保存0.3mL，做好日期標記后置于-80℃條件下保存12h后轉(zhuǎn)至液氮中長期保存。GB/TXXXXX—XXXXB.3.2四膜蟲的復蘇四膜蟲的復蘇操作步驟如下：a）將水浴鍋和SPP培養(yǎng)基提前預熱至42℃,從液氮中取出凍存管，先在水浴鍋中解凍15s，再加入1mLSPP培養(yǎng)基，再輕柔放于水浴鍋中繼續(xù)解凍。b）待完全融化成液體后，將四膜蟲培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至含有10mLSPP培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中培養(yǎng)，用無菌透氣封口膜封口，橡皮筋固定。c）將錐形瓶放入30℃恒溫振蕩器中，維持中速振搖（135r/min）培養(yǎng)，并觀察其長勢，約24h-48h可進行復蘇后的第一次傳代。B.4四膜蟲的培養(yǎng)B.4.1長期儲存培養(yǎng)在不經(jīng)常使用營養(yǎng)細胞、無法進行液氮保種時或需要進行長途運輸時，可用此方法維持四膜蟲的生存能力達數(shù)月之久。操作如下：a）將少許健康細胞轉(zhuǎn)入大豆培養(yǎng)基中。b）加入1ml-2mL無菌石蠟油防止蒸發(fā)，輕輕蓋上懸帽。c）15℃-20℃靜止培養(yǎng)。注：不建議用此方法進行保種，雖然此方法可以保存四膜蟲長達半年B.4.2快速營養(yǎng)繁殖四膜蟲在各種無菌培養(yǎng)容器中均可傳代培養(yǎng)，通常使用培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板，使用的初始種群密度應超過0.25×104cells/mL培養(yǎng)液，在30℃下進行中速振搖（135r/min），即可刺激其進行最大限度的營養(yǎng)繁殖。B.4.3傳代培養(yǎng)a）每24h-48h將1%-2%體積比的四膜蟲轉(zhuǎn)入新鮮的SPP培養(yǎng)基中進行非實驗條件下的常規(guī)傳代培養(yǎng)；b）在試驗條件下，需先確定種群密度，然后用新鮮的SPP培養(yǎng)基制成2×104cells/mL的四膜蟲培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。注1：培養(yǎng)裝置需維持充足的給氧空間，至少占培養(yǎng)注2：不能持續(xù)保持細胞指數(shù)增長，以防產(chǎn)生生長速率降低的無性系和端天（如，定在周末）不傳代的方法來恢復其生長的穩(wěn)定性，或定注4：條件允許的情況下，盡量每天檢查四膜蟲的游動狀態(tài)和種群密度以判斷其健康情況。健康的四膜蟲在未受到ABCDGB/TXXXXX—XXXXABCD（資料性）四膜蟲暴露試驗24孔板設置推薦方案在24孔板中，對一種受試物可使用如下所示的暴露方案進行試驗:GB/TXXXXX—XXXX（資料性）四膜蟲種群密度檢測相關參數(shù)設置推薦方案全自動細胞計數(shù)儀明場模塊下四膜蟲識別參數(shù)設置推薦如下：MinSize：20，MaxSize：GB/TXXXXX—XXXXABCDEFGH（資料性）四膜蟲相對種群活力檢測96孔板設置推薦方案在96孔板中，對兩種受試物可使用如下所示設置方案進行相對種群活力檢測：bbbbbbbbbbbbbMCSC濃濃濃濃濃濃濃bbMCSC度度度度度度度bbMCSC1234567bbMCSC濃濃濃濃濃濃濃bbMCSC度度度度度度度bbMCSC1234567bbbbbbbbbbbbbb表示空白孔。為防止蒸發(fā)效應，每孔加入等體積的SPP培養(yǎng)基；MC表示培養(yǎng)基對照組；SC表示溶劑對照組；第4列至第10列分別為從高到低7個試驗濃度的四膜蟲培養(yǎng)液；每個96孔板可檢測兩種受試物，如B-D行檢測受試物1，E-G行檢測受試物2。GB/TXXXXX—XXXX參考文獻[1]GerhardtA,Ud-DaulaA,SchrammKW.Tetrahymenaspp.(Protista,Ciliophora)astestspeciesinrapidmultilevelecotoxicitytests.ActaProtozool,2015,49:271-280[2]Cassidy-HanleyDM.Tetrahymenainthelaboratory:strainresources,methodsforculture,maintenance,andstorage.MethodsCellBiol,2012,109:237-27[3]HaoH,YuanSL,ChengSY,SunQ,GiesyJP,LiuCS.Effectsoftris(2-chloroethyl)phosphate(TCEP)ongrowth,reproductionandgenetranscriptionintheprotozoanTetrahymenathermophila.AquatToxicol,2020,222:105477[4]LiJ,GiesyJP,YuLQ,LiGY,LiuCS.EffectsofTris(1,3-dichloro-2-propyl)Phosphate(TDCPP)inTetrahymenaThermophila:TargetingtheRibosome.SciRep,2015,5:10562[5]LiJ,MaXF,SuGY,GiesyJP,XiaoY,ZhouBS,LetcherRJ,LiuCS.Multigenerationaleffectsoftris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphateonthefree-livingciliateprotozoaTetrahymenathermophilaexposedtoenvironmentallyrelevantconcentrationsandaftersubsequentrecovery.Environpollut,2016,218:50-58[6]ChengSY,LiuH,SunQ,KongR,LetcherRJ,LiuCS.Occurrenceofthefungusmycotoxin,ustiloxinA,insurfacewatersofpad