-國家重點實驗室電生理技術(shù)課件

離子通道的基礎(chǔ)知識及其技術(shù)醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室1.電生理學(xué)——生命科學(xué)中的信息科學(xué)組織的生物電場信息高級處理細(xì)胞的電脈沖信息整合和編碼細(xì)胞膜的電流電信號發(fā)生和傳遞1.電生理學(xué)——生命科學(xué)中的信息科學(xué)之一離子通道：生物電發(fā)生的基本元件，也是重要的藥物治療靶點。組織的生物電場信息高級處理細(xì)胞的電脈沖信息整合和編碼細(xì)胞膜的電流電信號發(fā)生和傳遞2.離子通道：重要的藥物靶點2.1重要的生理功能細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)參與維持細(xì)胞正常形態(tài)細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)和興奮-分泌偶聯(lián)細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)2.1重要的生理功能細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)——靜息電位的形成2.1重要的生理功能細(xì)胞生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)——動作電位的形成2.1重要的生理功能細(xì)胞興奮-分泌-興奮偶聯(lián)2.1重要的生理功能細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)2.離子通道：重要的藥物靶點2.2關(guān)鍵的藥物治療靶點2002年由FDA提供的分析報告指出，目前所有FDA認(rèn)可的藥品中涉及到的治療靶點基因僅為273個，其中完全認(rèn)定為藥物靶點的7%為離子通道；2006年的調(diào)研表明，配體門控和電壓門控的離子通道是第三和第四大現(xiàn)有的可治療基因家族（僅排在G蛋白基因家族和核受體基因家族之后），分別占據(jù)7.9%和5.5%；經(jīng)典的離子通道類臨床用藥見表1：藥物類別藥物靶點藥物名稱抗高血壓藥物鈣通道硝苯地平西尼地平鉀通道尼克地爾抗心律失常藥物鈉/鉀通道奎尼丁鈣通道地爾硫桌維拉帕米鉀通道胺碘酮麻醉藥鈉通道利多卡因普魯卡因氯通道/NMDA丙泊酚鎮(zhèn)靜/催眠/抗癲癇藥物鈉通道苯妥英鈉卡馬西平鈣通道乙琥胺鉀通道氯丙嗪氯通道苯二氮?缺血腦保護(hù)藥物鈣通道氟桂利嗪鈉通道利法利嗪鉀通道氟芬那酸糖尿病藥物鉀通道優(yōu)降糖、達(dá)美康表1.離子通道：重要的藥物靶點3.離子通道——分類分類方法具體類別電壓門控性，voltagegated又稱電壓依賴性(voltagedependent)或電壓敏感性(voltagesensitive)離子通道:因膜電位變化而開啟和關(guān)閉，以最容易通過的離子命名，如K+、Na+、Ca2+、Cl-通道4種主要類型，各型又分若干亞型.配體門控性，ligandgated又稱化學(xué)門控性(chemicalgated)離子通道，由遞質(zhì)與通道蛋白質(zhì)受體分子上的結(jié)合位點結(jié)合而開啟，以遞質(zhì)受體命名，如乙酰膽堿受體通道、谷氨酸受體通道、門冬氨酸受體通道等.非選擇性陽離子通道(non-selectivecationchannels)系由配體作用于相應(yīng)受體而開放，同時允許Na+、Ca2+

或K+

通過，屬于該類.機械門控性，mechanogated又稱機械敏感性(mechanosensitive)離子通道:是一類感受細(xì)胞膜表面應(yīng)力變化，實現(xiàn)胞外機械信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道，根據(jù)通透性分為離子選擇性和非離子選擇性通道，根據(jù)功能作用分為張力激活型和張力失活型離子通道.基因相似性根據(jù)基因序列的相似性或同源性而歸類的離子通道，例如TRP家族等。在1902年，Bernstein創(chuàng)造性地將Nernst的理論應(yīng)用到生物膜上，提出了“膜學(xué)說”。他認(rèn)為在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜只對鉀離子具有通透性，即細(xì)胞靜息電位的鉀離子學(xué)說；而當(dāng)細(xì)胞興奮的瞬間，膜的破裂使其喪失了選擇通透性，所有的離子都可以自由通過。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世紀(jì)30—50年代做出了開創(chuàng)性研究。他們基于電壓鉗技術(shù)，提出并驗證了所謂的Hodgkin—Huxley方程，數(shù)學(xué)模擬出和真實狀況相符合的神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，由此建立了細(xì)胞動作電位的鈉離子學(xué)說。離子通道的近代觀念也由此產(chǎn)生。4.離子通道研究理論4.離子通道研究技術(shù)微電極電壓鉗-電流鉗技術(shù)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)4.離子通道研究技術(shù)3.平板膜片鉗技術(shù)（膜片鉗技術(shù)新趨勢的關(guān)鍵）原創(chuàng)技術(shù)專利：表2.膜片鉗技術(shù)的歷史角色年份電生理學(xué)中標(biāo)志性事件1786LuigiGalvani首次在蛙類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)生物電現(xiàn)象，電生理學(xué)的創(chuàng)始人，1887SidneyRinger發(fā)明了蛙心灌流試驗用的溶液。1888WaltherNernst提出了Nernst方程。1902JuliusBemstein提出靜息電位的K+學(xué)說。1937Renshaw首次使用微電極成功記錄到了脊髓中間神經(jīng)元的電活動。1946Gerard首次使用微電極測定了蛙肌細(xì)胞膜電位。1949Ling發(fā)明了微電極細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)，Cole首創(chuàng)的電壓鉗技術(shù)問世，成為電生理學(xué)史上重要的里程碑，電生理研究進(jìn)入細(xì)胞時代。1949Hodgkin和Katz提出了動作電位Na+學(xué)說。1952Hodgkin和Huxley分離出Na+、K+電流和漏電流。1953Fatt和Katz分離出了Ca2+電流。1964Deck、Kern和Trantwein在浦肯野氏纖維上進(jìn)行電壓鉗研究。1976E.Neher和B.Sakmann創(chuàng)立了膜片鉗技術(shù)，使電生理研究空前活躍，并作為重要的里程碑，標(biāo)志著電生理分子時代的到來。1980~膜片鉗技術(shù)、生物大分子技術(shù)以及生物光學(xué)技術(shù)的結(jié)合，使人們對生物電現(xiàn)象的認(rèn)識水平在分子水平取得了重大的突破和豐富。5.傳統(tǒng)膜片鉗設(shè)備的組成電學(xué)部分信號放大器數(shù)據(jù)采集卡

PC周邊設(shè)備控制器等光學(xué)部分：熒光顯微鏡

CCD照相機監(jiān)視器激光器等機械部分防震臺，氣壓泵或氣瓶高精密微電極操作器灌流操作器顯微鏡移動平臺或可移動載物臺輔助部分：信號屏蔽罩微電極拉制儀藥物灌流設(shè)備溫度控制器6.全自動膜片鉗設(shè)備的組成工作站平板芯片+即：德國Nanion公司Patchliner德國Nanion公司Syncropatch96美國MolecularDevices公司Ionworks7.不同膜片鉗技術(shù)的比較1記錄模式傳統(tǒng)膜片鉗平板膜片鉗7.不同膜片鉗技術(shù)的比較傳統(tǒng)膜片鉗高信息量：通道功能的各項指標(biāo)、結(jié)合其他實驗記錄高靈敏度：pA級、單通道水平適用范圍廣：不受樣本種類限制操作過程復(fù)雜，對實驗者要求高實驗數(shù)據(jù)量低，難以應(yīng)用于藥物篩選全自動膜片鉗操作自動化，簡單培訓(xùn)即可使用高效率、高通量實現(xiàn)某些傳統(tǒng)膜片鉗不具有的功能，例如全細(xì)胞模式內(nèi)液灌流。保持傳統(tǒng)膜片鉗高信息量和高靈敏度方面程度不一，樣本兼容性不一2各自的優(yōu)缺