固定化酶和固定化細胞

固定化酶和固定化細胞固定化酶的定義所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復和連續(xù)使用的酶。themegallery.1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)酶的固定化現(xiàn)象；1969年，千畑一郎等將固定化氨基酰化酶應用于生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應用于工業(yè)生產(chǎn)的先例；1971年召開的第一屆國際酶工程會議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱ImmobilizedEnzyme；1973年，固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸。1986年，利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。酶固定化技術開展史themegallery.從目前的開展狀況來看，盡管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對有限，采用固定化酶技術大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的十幾個酶種，故仍需大力研究開發(fā)使更多的固定化酶和細胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。開展現(xiàn)狀themegallery.固定化酶的優(yōu)點同一批固定化酶能在工藝流程中重復屢次地使用；固定化后，和反響物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟；穩(wěn)定性顯著提高；可長期使用，并可預測衰變的速度；提供了研究酶動力學的良好模型。themegallery.固定化酶的制備原那么〔1〕必須注意維持酶的構象，特別是活性中心的構象?！?〕酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復使用。〔3〕固定化應有利于自動化、機械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機械強度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。themegallery.〔4〕固定化酶應有最小的空間位阻。〔5〕固定化酶應有最大的穩(wěn)定性。在應用過程中，所選載體應不和底物、產(chǎn)物或反響液發(fā)生化學反響。〔6〕固定化酶的本錢適中。themegallery.固定化酶〔細胞〕的制備方法

酶和細胞固定化方法

載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法

網(wǎng)格型微囊型物理吸附法離子結(jié)合法共價結(jié)合法熱處理〔細胞〕themegallery.themegallery.1、吸附法通過載體外表和酶分子外表間的次級鍵相互作用而到達固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。themegallery.物理吸附法(physicaladsorption)是通過非特異性物理吸附作用將酶直接吸附在水不溶性載體外表上而使酶固定化的方法。包括范德華力、疏水相互作用、氫鍵。物理吸附法常用的載體：有機載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋等；無機載體：活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。物理吸附法themegallery.離子吸附法(ionadsorption)是通過離子鍵使酶與含有離子交換基團的水不溶性載體相結(jié)合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構酶、糖化酶、β-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。離子吸附法themegallery.離子吸附法常用的載體：陰離子交換劑：DEAE-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素等；陽離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法具有操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點。此外，吸附過程同時可以純化酶。themegallery.2、包埋法包埋法〔entrapment〕是將酶包埋在高聚物的細微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。themegallery.〔1〕凝膠包埋法將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進劑(包括交聯(lián)劑)的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以到達固定化。凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。themegallery.〔2〕微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類似細胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。themegallery.3、共價鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法(covalentbinding〕是將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。themegallery.〔1〕酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基?！?〕酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基?！?〕苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)?！?〕其他：半胱氨酸殘基的巰基；絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基；組氨酸殘基的咪唑基；色氨酸殘基的吲哚基。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團酶共價偶聯(lián)的載體的功能基團：芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。themegallery.載體活化的主要反響重氮法疊氮法溴化氰法芳香烴化法themegallery.〔1〕重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。themegallery.〔2〕疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應基團偶聯(lián)成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex〔交聯(lián)葡聚糖〕、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。themegallery.〔3〕溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。themegallery.〔4〕烷基化和芳基化法以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反響而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。themegallery.優(yōu)點：共價鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點。缺點：載體活化的難度較大，操作復雜，反響條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學反響，易引起酶蛋白空間構象變化。themegallery.4、交聯(lián)法交聯(lián)法〔cross-linking〕是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構的固定化方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物等。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反響，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。themegallery.themegallery.5、選擇性熱變性法專用于細胞固定化。是將細胞在適當?shù)臏囟认绿幚硎辜毎さ鞍鬃冃?，但不使酶變性而使酶固定于細胞?nèi)的方法。themegallery.6、固定化活細胞將活細胞限制或定位于特定空間位置的方法。themegallery.無需進行酶的別離和純化，減少酶的活力損失，同時大大降低了本錢；保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強；細胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反響，且不需添加輔助因子；細胞生長停滯時間短，細胞多，反響快等。固定化活細胞的優(yōu)越性themegallery.缺點必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否那么影響產(chǎn)物的純度；必須抑制細胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物；載體、細胞膜或細胞壁會造成底物滲透與擴散的障礙等。themegallery.制備方法固定化活細胞的制備條件比固定化酶更要溫和，其制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。themegallery.固定化酶的特性固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒狀、纖維狀、酶膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和纖維狀主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反響器中進行批式攪拌反響。themegallery.固定化酶的性質(zhì)酶活力酶穩(wěn)定性酶學特性themegallery.固定化酶的酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸殘基被載體結(jié)合；高級結(jié)構和空間構象的改變；空間位阻的影響；內(nèi)擴散阻力；半透膜的隔離。個別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高。themegallery.固定化酶的穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性：體內(nèi)半衰期貯藏穩(wěn)定性：低溫放置熱穩(wěn)定性：耐熱性提高對蛋白酶的穩(wěn)定性：空間位阻其他：對有機溶劑、pH、酶抑制劑等的穩(wěn)定性均有提高。themegallery.固定化酶的酶學特性底物特異性：對高分子底物的活性明顯下降；最適pH：最適pH和pH曲線常會發(fā)生偏移；最適溫度：多數(shù)較游離酶高；動力學常數(shù)：Km均增大，增大幅度視情況而定；最大反響速度：與游離酶大多數(shù)是相同或相近。themegallery.酶反響器及其類型酶反響器的定義以酶為催化劑進行反響所需要的設備稱之為酶催化反響器，簡稱酶反響器。themegallery.酶反響器的類型間歇式攪拌罐反響器，BSTR連續(xù)流動攪拌罐反響器，CSTR填充床反響器，PBR流化床反響器，F(xiàn)BR連續(xù)攪拌罐-超濾膜反響器，CSTR/UFR循環(huán)式反響器，RCRthemegallery.反響器的結(jié)構特點這類反響器結(jié)構簡單，造價較低，傳質(zhì)阻力很小，反響能迅速到達穩(wěn)態(tài)，主要應用在飲料和食品工業(yè)中。其缺點是操作麻煩，在反復回收過程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。常用于游離酶。BSTR間歇式攪拌罐反響器，BSTRthemegallery.這種反響器在運轉(zhuǎn)過程中，底物以恒定的流速流入反響器，與此同時，反響液那么以同樣的流速流出反響器。反響桶內(nèi)裝有攪拌器，使反響組分與固定化酶顆?；旌暇唬隹谔幱羞^濾膜，可使不斷補充新鮮底物與反響液流量維持動態(tài)平衡。連續(xù)流動攪拌罐反響器，CSTRCSTRthemegallery.優(yōu)點：反響液混合良好，各部位的成分相同，并與流出液的組成也一致。CSTR的開放結(jié)構使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利于控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有較高的轉(zhuǎn)化率。缺點：由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。需改進的CSTR。themegallery.填充床反響器，PBRPBR又稱固定床反響器?？商畛涠嘞虍愋园胪感灾锌绽w維制成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。在填充床反響器內(nèi)，底物在一定方向上以恒定的速度通過固定化酶柱，以近似活塞式流動反響器〔PlugFlowReactor，PFR〕運轉(zhuǎn)。themegallery.流化床反響器，F(xiàn)BRFBRFBR—種裝有較小顆粒的垂直塔式反響器。反響時，底物溶液以足夠大的流速，從反響器底部向上通過固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之間。由于反響器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好，可處理粘性大、含有固體顆粒的底物。themegallery.連續(xù)攪拌罐-超濾膜反響器，CSTR/UFRCSTR/UFRCSTR／UF結(jié)構是CSTR與超濾裝置聯(lián)用的酶膜反響器。在CSTR出口處設置一個超濾裝置，通過超濾裝置，酶可以循環(huán)使用。該超濾器中的半透性超濾膜只允許小分子產(chǎn)物通過，不允許大分子酶和底物通過。該反響器適用于顆粒較細的固定化酶、游離酶和細胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。themegallery.循環(huán)式反響器，RCR外循環(huán)反響器內(nèi)循環(huán)反響器循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸時機，以到達所需的轉(zhuǎn)化率。這種反響器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反響。themegallery.酶反響器的選擇依據(jù)根據(jù)固定化酶的形狀：溶液酶：BSTR顆粒狀和片狀：CSTR、PBR膜狀和纖維狀：PBR容易變形、易粘結(jié)、顆粒細小：FBR根據(jù)底物的物理性質(zhì)溶解性和濁液性底物：任何類型顆粒狀和膠狀底物：CSTR、FBR、RCRthemegallery.根據(jù)酶反響動力學特性產(chǎn)物對酶活性抑制：PBR底物對酶活性抑制：CSTR根據(jù)外界環(huán)境對酶的穩(wěn)定性的影響改進的CSTR根據(jù)操作要求及反響器費用CSTRthemegallery.固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸根本原理青霉素G經(jīng)青霉素酰化酶作用，水解除去側(cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無側(cè)鏈青霉素。6-APA結(jié)構式themegallery.工藝路線大腸桿菌的培養(yǎng)大腸桿菌固定化固定化大腸桿菌反響堆制備轉(zhuǎn)化反響6-氨基青霉烷酸的提取themegallery.工藝要點大腸桿菌的培養(yǎng)菌種：大腸桿菌D816斜面培養(yǎng)基：普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來水發(fā)酵條件：通氣攪拌培養(yǎng)，28℃，pH7.0themegallery.大腸桿菌固定化取濕菌體100kg，置于40℃反響罐中，在攪拌下參加50L10%戊二醛5升，在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤中，使之成為3-5cm厚的液層，室溫放置2小時，再轉(zhuǎn)移至