番茄細(xì)菌性斑點病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程

1番茄細(xì)菌性斑點病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了番茄細(xì)菌性斑點病抗性的相關(guān)術(shù)語和定義、接種體制備、病原菌鑒定、鑒定條件和試驗設(shè)計、接種、病情調(diào)查、抗病性評價的操作指示。本文件適用于番茄細(xì)菌性斑點病抗病性苗期室內(nèi)鑒定和評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T1858.1番茄主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第1部分：番茄抗晚疫病鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義NY/T1858.1界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1番茄細(xì)菌性斑點病由丁香假單胞桿菌番琉致病變種（Pseudomonassyringaepv.tomato）引起。葉片是主要的受危害部位，葉片邊緣發(fā)病明顯。初期斑點細(xì)小，呈圓形或近圓形，中間深褐色，周圍有黃色暈圈，隨后病斑慢慢擴大、增多，發(fā)病中后期，病斑變成黑色、深褐色，病斑直徑2mm～4mm，多個病斑可相互連接形成不規(guī)則的較大病斑。4試劑與材料4.1試劑所用試劑在未加說明時均采用分析純試劑。實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682中規(guī)定的三級水要求。4.2NA液體培養(yǎng)基稱取牛肉浸膏3g，蛋白胨8g，蔗糖或葡萄糖10g，酵母浸膏1g，加蒸儲水至1000mL，加熱煮沸，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝，高壓滅菌(121℃,25min)。4.3NA固體培養(yǎng)基稱取牛肉浸膏3g，蛋白胨8g，蔗糖或葡萄糖10g，酵母浸膏1g，加蒸儲水至1000mL，先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其余各成分用少量水化開加入，煮沸，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝，高壓滅菌(121℃,25min)。5接種體制備5.1病原菌分離5.1.1采樣時選取發(fā)病典型、新發(fā)病的番茄葉片，用封口袋保存，做好采集地點、時間的記錄，及時帶回實驗室，用常規(guī)組織分離法分離病原菌。25.1.2將工具放置在超凈工作臺上，打開紫外燈滅菌40min。用剪刀剪取病健交界處組織并制片，在顯微鏡下進行觀察是否具有噴菌現(xiàn)象。將出現(xiàn)噴菌現(xiàn)象的組織在無菌條件下進行分離。用75％的乙醇溶液消毒30s后用無菌水沖洗1次，再用0.1％HgCl消毒20s后用無菌水沖洗3次。將清洗后的組織剪碎，加入3ml無菌水，靜置10min。接種環(huán)在酒精燈上燒紅后晾冷，沾取菌液，在NA固體培養(yǎng)基上劃線。于28℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。5.2病原菌純化分離培養(yǎng)2d后，用消毒接種環(huán)挑選單菌落在NA固體培養(yǎng)基上進行劃線。重復(fù)進行純化操作，直至菌落形態(tài)一致，無雜菌。5.3接種體保存將純化菌落移至1ml滅菌離心管中，放置在-25℃冰箱中保存。6病原菌鑒定6.1致病性鑒定6.1.1接種懸浮液制備將保存的病原菌轉(zhuǎn)移到NA液體培養(yǎng)基中，溫度28℃,轉(zhuǎn)速120r/min，震蕩培養(yǎng)48h。在波長λ=600的條件下測定OD值，將菌液稀釋至OD值0.6～0.8，菌液濃度為1×108cfu/ml。6.1.2煙草過敏反應(yīng)用注射器吸取菌液，沿著葉脈注射到煙草葉片葉肉組織中，24h后觀察是否出現(xiàn)斑枯過敏反應(yīng)。6.1.3接種用注射器吸取菌液，沿著葉脈注射到健康番茄植株葉片組織中，接種后，置于溫度25℃,空氣濕度90％～100％的人工氣候箱中培養(yǎng)。6.1.4結(jié)果判定煙草發(fā)生斑枯過敏反應(yīng)和接種健康番茄植株后，葉片出現(xiàn)斑點，斑點有黃色暈圈等典型癥狀可初步判定病原菌為番茄細(xì)菌性斑點病致病菌。6.2病原菌16srDNA分子鑒定6.2.1DNA制備保存的接種體活化后，用接種環(huán)挑取1環(huán)新鮮的菌落放入裝有0.5ml滅菌水的離心管中，置于震蕩器充分震蕩混勻。放入100℃水中加熱5min后，快速轉(zhuǎn)入冰水混合物中放置10min。在轉(zhuǎn)速4000r/min，離心10min后，取上清液。6.2.2PCR擴增以病原細(xì)菌的總基因組DNA為模板，上游引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游引物1942R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增。6.2.3結(jié)果判定將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果在GenBank中進行序列比對。7鑒定條件和實驗設(shè)計7.1鑒定室苗期抗病性鑒定的鑒定室能夠人工調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度、濕度和光照，使之具備良好的發(fā)病環(huán)境。7.2鑒定設(shè)計3鑒定材料隨機區(qū)組排列，每份鑒定材料重復(fù)3次，每次重復(fù)10株苗。7.3鑒定材料育苗7.3.1將鑒定材料的種子放入50℃~55℃的溫水中浸泡20min～30min，待水溫降至室溫后，繼續(xù)浸種6h。浸種后，將種子包裹在濕布中，放入36℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。7.3.2待種子露白后播于72孔穴盤中。育苗基質(zhì)為椰糠、泥炭和珍珠巖（2:1:1），經(jīng)高溫蒸汽滅菌后方可使用。7.3.3在溫室內(nèi)育苗，室內(nèi)溫度18℃~25℃,幼苗應(yīng)生長健壯、一致。育苗期間不應(yīng)使用殺菌劑。8接種8.1接種時期幼苗在3～5片真葉期進行接種。8.2接種方法采用傷莖噴霧法接種。用小刀在番茄的莖部刮出1條1.5cm長的傷口，用小型噴霧器將配置的接種懸浮液（配置方法見6.1.1）均勻噴霧到傷口處，每隔2h重復(fù)操作，共重復(fù)3次。8.3接種后管理接種后的室內(nèi)溫度為23.6℃~28℃,濕度為90100保濕時間在96h以上，正常栽培管理。9病情調(diào)查9.1病情級別劃分幼苗病情級別及相對應(yīng)的癥狀描述見表1。表1番茄細(xì)菌性斑點病病情級別劃分01病斑面積占葉片面積≤5%25病斑面積占葉片面積≤10%310病斑面積占葉片面積≤25%425病斑面積占葉片面積≤50%550病斑面積占葉片面積＜100%9.2調(diào)查時間接種后12d～16d進行。9.3病情記載調(diào)査記載每一鑒定植株的病情級別，并計算病情指數(shù)，按公式（1）