實驗四-酵母分批培養(yǎng)實驗

PAGEPAGE6實驗四酵母分批培養(yǎng)實驗一、目的掌握微生物分批培養(yǎng)的生物反應(yīng)器操作；掌握的菌體濃度、總糖等參數(shù)測定方法；掌握分批培養(yǎng)的生長動力學(xué)及生長曲線的測定方法。了解酵母的生長特性。二、原理分批反應(yīng)操作是指基質(zhì)滅菌、接種以后，除了好氧反應(yīng)需要在反應(yīng)過程中通入無菌空氣、消除泡沫所用的消泡劑以及維持一定pH值所用酸堿之外，反應(yīng)過程中不再加入反應(yīng)基質(zhì)?；|(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度以及細胞濃度均隨反應(yīng)進行的時間而變化，尤其是菌體本身將經(jīng)歷不同的生長階段（在培養(yǎng)的過程中，微生物的生長可分為遲緩期、對數(shù)生長期、減速期、靜止期），顯示出不同的催化活力?；咎卣魇牵悍磻?yīng)物料一次加入一次卸出；反應(yīng)器物系的組成僅隨時間而變化，即隨著培養(yǎng)的進行，基質(zhì)的濃度下降，菌體量增加，產(chǎn)物增加。因此它屬于一非穩(wěn)態(tài)過程。三、主要試劑與設(shè)備酵母、培養(yǎng)基、菲林試劑、0.05NNaOH1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液等100L機械攪拌式反應(yīng)器、pH計、離心機、分光光度計等四、步驟（一）準(zhǔn)備工作1.發(fā)酵罐的組裝工作（1）連接好冷卻水管。若采用自來水冷卻，要考慮到白天與夜間水壓的變化，盡可能采用耐壓管，連接部要充分牢固，并且注意連接管管徑與自來水管管徑應(yīng)一致。（2）由于通人的空氣有一定壓力，應(yīng)注意連接壓縮空氣的管子應(yīng)能承受一定壓力。（3）安裝pH及溶解氧等檢測裝置，注意各接線口不要出現(xiàn)差錯。由于操作過程要和水打交道，故線路連接一定要注意安全，要特別注意防止漏電。2.種子培養(yǎng)液體試管培養(yǎng)：自斜面菌種挑取一環(huán)酵母菌體，接入裝有10ml10-12oBx無菌麥芽汁的液體試管中。搖勻，置于30℃三角瓶裝培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)好的液體試管種子接入250m1三角瓶的滅過菌的10010-12oBx的麥芽汁，接種量10%，30℃3.培養(yǎng)基的配置：按配方配置發(fā)酵罐。培養(yǎng)基的體積通常為罐容積的50-60%。準(zhǔn)確稱量培養(yǎng)基各組分，溶解。一般配置培養(yǎng)基的體積為預(yù)定的70%，因為滅菌時，通入的蒸汽發(fā)生冷凝，會使發(fā)酵液的體積增加。使用合成培養(yǎng)基時，將糖類及磷酸鹽溶液分別用高壓滅菌鍋滅菌，開始培養(yǎng)前放入發(fā)酵罐內(nèi)，這是為了避免滅菌時糖類物質(zhì)與氨基化合物反應(yīng)生成褐色物質(zhì)，以及防止磷酸鹽與其它金屬離子生成沉淀。4.發(fā)酵裝置(罐)的清洗發(fā)酵罐使用前后都應(yīng)認真清洗，特別是前后兩次培養(yǎng)采用不同的菌株時，更應(yīng)注意清洗和殺菌工作。發(fā)酵罐有多種型式，罐內(nèi)(可進行清洗的)任何部分都應(yīng)認真清洗，否則都可能成為雜菌的滋生地。一般認為，發(fā)酵前期引起雜染菌的主要原因是由于清洗不凈。易被忽略而未能充分清洗的地方有噴嘴內(nèi)部與取樣管內(nèi)以及罐頂?shù)忍?。另外，還應(yīng)充分注意發(fā)酵罐周圍的附件設(shè)備，如加熱器、電機等的安全使用。5.電極的標(biāo)定對pH電極和溶氧電極進行零點校正和斜率校正。6.參數(shù)的控制及設(shè)定根據(jù)發(fā)酵要求在操作面板或反應(yīng)器應(yīng)用程序上進行設(shè)定。發(fā)酵控制參數(shù)值如下：溫度30℃時間48h,空氣流量——（三）發(fā)酵罐發(fā)酵步驟如下：清洗→空消→實消→冷卻→接種→發(fā)酵→取樣→放罐1.蒸汽的產(chǎn)生打開蒸汽發(fā)生器進水閥和放氣閥，加水至水位上限，關(guān)閉進水閥和放氣閥。啟動蒸汽發(fā)生器電源開關(guān)加熱至0.40MPa左右。2.空消空氣過濾系統(tǒng)只空消，不實消，以免實消罐中物料沖入過濾器內(nèi)；通蒸汽前檢反應(yīng)器所有閥門是否關(guān)閉。打開蒸汽發(fā)生器排冷凝水的閥門，排放冷凝水至蒸汽出現(xiàn)，關(guān)閉此閥門；然后打開蒸汽發(fā)生器供給反應(yīng)器蒸汽的閥門。進蒸汽順著蒸汽管路開閥門，蒸汽為活汽。打開罐頂排氣，先對空氣過濾系統(tǒng)滅菌，順著氣路開閥，再開尾閥排冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥，保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓；再進罐體，蒸汽分三路進罐，先主管道，后次管道；蒸汽也按以上規(guī)則順行進路徑開閥，先開支路閥，再開排汽閥，最后為進罐閥。罐壓升至0.12MPa(此時控制系統(tǒng)中溫度讀數(shù)約為120℃左右)時開始計時，滅菌30min。滅菌時，保持各閥排氣通暢，防止存在死角。滅菌結(jié)束時，逆著進路關(guān)閥門?？諝膺^濾系統(tǒng)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥，完成；進罐蒸汽管路先關(guān)進汽閥，再排汽閥，最后為支路閥。但空消一結(jié)束，即要通入無菌空氣吹干空氣過濾系統(tǒng)管路并保壓，避免染菌。打開罐頂排汽閥直至表壓為零，再通過罐底排空罐里的冷凝水。注：粗過濾器不空消也不實消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過濾器的閥門。3.實消將pH電極和溶氧電極裝上，懸緊螺旋。打開進料口進料。進料完成后，向夾套中通入蒸汽將發(fā)酵液加熱至80℃以上，關(guān)閉蒸汽閥門。隨后向發(fā)酵液通入蒸汽至0.12MPa4.冷卻：滅菌結(jié)束后，立即打開冷卻水（下進上出）至30℃5.接種、發(fā)酵：適當(dāng)降低通風(fēng)量，使高壓接近零。在接種口（進料口）周圍放置浸有酒精的棉花，點燃后迅速打開接種口，將菌種加入到發(fā)酵罐中，旋緊接種口蓋子，熄滅火焰，調(diào)節(jié)通風(fēng)量，接上玻璃轉(zhuǎn)子流量計，使流量計讀數(shù)在8.0左右，同時保持罐壓0.04Mpa，保溫保壓發(fā)酵48hr6.取樣培養(yǎng)基放入罐前取50ml，測定其還原糖，菌體量。發(fā)酵每隔4h后取樣100m測定菌體量、總還原糖。取樣時，將取樣口最初的10ml培養(yǎng)液棄掉。具體操作如下：須提前半小時，開啟蒸汽發(fā)生器，送入蒸汽，開啟閥門1，2，蒸汽滅菌。半小時后，關(guān)閥門1，立即開啟閥門3，先放棄部分培養(yǎng)液，再取樣100ml左右至滅菌三角瓶中（標(biāo)注好取樣日期、時間、取樣人），冷藏備測。關(guān)閉閥門3，開啟閥門1，半小時后關(guān)閉閥門2，再關(guān)閥門1。7.放罐：培養(yǎng)完成時，除取出足夠量的培養(yǎng)液作為樣品外，剩余培養(yǎng)液要經(jīng)過殺菌處理。此時發(fā)酵罐所裝有的電極可一同經(jīng)殺菌處理。如果培養(yǎng)液為無害物質(zhì)，可將電極單獨取出處理，以利于延長電極使用壽命。殺菌完成后，溫度降低到一定溫度時，取出電極，將殺菌后培養(yǎng)液丟棄到指定地點。一般培養(yǎng)液溫度較高時，有難聞氣味產(chǎn)生，因此，排放溫度應(yīng)盡可能低一些。8.清洗：空罐后，加大排氣，使表壓掉零，取出各探頭，加蓋，由進料口加入凈水關(guān)好，罐內(nèi)升壓，放罐，如此重復(fù)兩次。清洗、空消、實消、冷卻操作完全一致；五、記錄、數(shù)據(jù)處理測定方法：1.菌體濃度測定：將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，在660nm，波長下測其濁度，同時采用血球記數(shù)。2.還原糖測定方法：采用菲林法測定。記錄：數(shù)據(jù)采集：系統(tǒng)自動采集，每2min采集一組數(shù)據(jù)并存貯，包括：溫度、溶氧、pH、等，系統(tǒng)可自動給出有關(guān)曲線。同時由值班者每30min記錄一次，準(zhǔn)確填表，獲取數(shù)據(jù)制作過程曲線。值班人員做好記錄，發(fā)酵罐每隔4h取樣。按表1記錄。表1酵母發(fā)酵批報罐批1接種時間14:26放罐時間取樣時間14:4419:2022:3001：2004：2007：2015：24培養(yǎng)時間/h0.304.908.0710.9013.9016.9024.97pH6.075.935.44.934.474.494.11罐溫℃33.9030.2031.1031.1031.7032.0032.40OD0.9430.8831.2501.3601.5161.5141.880菌體濃度/（個/1.00E-4mL）71055510701290178050785250還原糖/(mg/100mL)268824442067192016801519840取樣時間18：2421：2800：2803：2806：2809：2811：18培養(yǎng)時間/h27.9731.0334.0337.0340.0343.0344.87pH3.953.913.813.753.883.853.84罐溫℃31.5030.2031.7032.0031.8032.00OD1.9921.9274.8324.5723.9164.4684.468菌體濃度/（個/1.00E-4mL）5550530047202940104034005380還原糖/(mg/100mL)67243027221379.552.544.6（三）以時間為橫坐標(biāo)，菌體濃度、還原糖%、pH、OD為縱坐標(biāo)作圖，觀察各參數(shù)的變化。采用計算機擬和對數(shù)生長期的動力學(xué)方程。圖1菌體濃度-t圖圖2還原糖-t圖圖3pH-t圖圖4OD-t圖由圖1可看出，22:30-07：20為對數(shù)生長期表2對數(shù)生長期部分?jǐn)?shù)據(jù)表取樣時間19:2022:3001：2004：2007：20培養(yǎng)時間/h4.908.0710.9013.9016.90OD0.8831.2501.3601.5161.514菌體濃度/（個/1.00E-4mL）5551070129017805078還原糖/(mg/100mL)24442067192016801519pH5.935.44.934.474.49t-t'03.176.009.0012.00In(X/X')00.6560.8431.1652.214注：t為培養(yǎng)時間/h，X為菌體量/（個/1.00E-4mL）。t’X’為19：20時對應(yīng)的培養(yǎng)時間和菌體濃度，t’=4.90，X’=555（個/1.00E-4mL）圖5以菌體數(shù)量擬合對數(shù)生長期動力學(xué)方程所以，對數(shù)生長期動力學(xué)方程：dX/dt=0.1701X（四）用圖示表示比生長速率[μ=(dX/dt)/X隨時間變化趨勢。培養(yǎng)時間/h0.304.908.0710.9013.9016.9024.97菌體量/（1.00E-4mL）71055510701290178050785250μ-0.05350.2070.06610.1070.3490.00413培養(yǎng)時間/h27.9731.0334.0337.0340.0343.0344.87菌體量/（1.00E-4mL）5550530047202940104034005380μ0.0185-0.0151-0.0386-0.158-0.3460.3950.249t為取樣時的培養(yǎng)時間，t’為前一次取樣時的培養(yǎng)時間X為取樣時的菌體濃度，X’為前一次取樣時的菌體濃度μ=In(X/X’)/(t-t’)μ為t-t’時代平均比生長速率圖6比生長速率圖六、思考題：空消時，應(yīng)注意什么？（1）空消時，一定要排盡發(fā)酵罐夾套內(nèi)的余水。否則可能會導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)筒體壓扁，造成設(shè)備損壞。

（2）設(shè)備初次使用或長期不用后啟動時，最好采用間歇空消，以便消除芽孢。（3）空氣過濾系統(tǒng)只空消，不實消，以免實消罐中物料沖入過濾器內(nèi)；粗過濾器不空消也不實消。（4）除菌過濾器的濾芯不能承受高溫高壓，因此，蒸汽減壓閥必須調(diào)整在0.13Mpa，不能超過0.15Mpa（關(guān)于兩個壓力值，從不同的地方查到的數(shù)據(jù)相互間有出入，具體可根據(jù)設(shè)備而異）。（5）空消時開尾閥排冷凝水，排掉冷空氣，保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。（6）空消時，溶氧電極，pH電極取出，可以延長使用壽命。（7）空消一結(jié)束，即要通入無菌空氣吹干空氣過濾系統(tǒng)管路并保壓，避免染菌。微生物接種一般接種方法有幾種？（1）火焰接種法：在接種口用酒精火圈消毒，然后打開接種口蓋，迅速將接種液倒入罐內(nèi)，在把蓋擰緊。（2）差壓法：在滅菌前放入墊片，接種時把接種口蓋打開，先倒入一定量的酒精消毒。待片刻后把種液瓶的針頭插入接種口的墊片。利用罐內(nèi)壓力和種液瓶內(nèi)的壓力差，將種液引入罐內(nèi)，擰緊蓋子。配置培養(yǎng)基應(yīng)注意什么？（1）一般配置培養(yǎng)基的體積為預(yù)定的70%，因為滅菌時，通入的蒸汽發(fā)生冷凝，會使發(fā)酵液的體積增加。（2）使用合成培養(yǎng)基時，將糖類及磷酸鹽溶液分別用高壓滅菌鍋滅菌，開始培養(yǎng)前放入發(fā)酵罐內(nèi)，這是為了避免滅菌時糖類物質(zhì)與氨基化合物反應(yīng)生成褐色物質(zhì)，以及防止磷酸鹽與其它金屬離子生成沉淀。七、分析討論：1.關(guān)于OD值與菌體量變化的分析比較表3OD值與菌體量變化比較表取樣時間14:4419:2022:3001：2004：2007：2015：24OD0.9430.8831.2501.3601.5161.5141.880菌體濃度/（個/1.00E-7mL）0.7100.5551.0701.2901.7805.0785.250對應(yīng)圖6中編號1234567取樣時間18：2421：2800：2803：2806：2809：2811：18OD1.9921.9274.8324.5723.9164.4684.468菌體濃度/（個/1.00E-7mL）5.5505.3004.7202.9401.0403.4005.380對應(yīng)圖6中編號891011121314圖6OD值與菌體量變化比較圖圖中虛線為菌體濃度變化，實線為OD值變化由圖可看出，在第6至9個點（即07：20-21：28）段OD值與菌體濃度變化趨勢相差較大?？赡茉蚴牵壕w濃度在5-6間（04：20-07：20）迅速積累，細胞的增殖速度超過細胞物質(zhì)的合成速度，導(dǎo)致分裂后的菌體體積減小，相同菌體濃度的吸光度下降，所以O(shè)D值并不立即隨菌濃度量上升而上升。直到9-10段（21：28-00：28）菌體合成大量細胞物質(zhì)使吸光度上升。但OD值相對菌體濃度變化的滯后一般不會太長，而本次實驗中則滯后了約17h。這可能是因為在08：10-14：24間斷電，停止通氧導(dǎo)致菌體代謝減慢，在從新開始供氧后菌體又需要一段時間適應(yīng)環(huán)境變化，恢復(fù)代謝，從而導(dǎo)致OD值對菌體濃度滯后時間長。另外，在缺氧時，可能會出現(xiàn)某些代謝產(chǎn)物積累，影響之后的菌體代謝，這也會延長OD值對菌體濃度的滯后時間。在第10至14個點（即00：28-11：18）段OD值變化趨勢與菌體濃度相同，但變化程度菌體濃度遠大于OD值?？赡茉蚴牵壕w裂解后的細胞碎片的干擾導(dǎo)致測得的OD值偏大。2.菌體濃度在06：28-11：18時間段上升到原因?qū)嶒炇褂玫呐囵B(yǎng)基中除葡萄糖外還還有大量其它糖類，當(dāng)葡萄糖被消耗完后菌體大量死亡，但也有部分菌合成利用其它糖類的誘導(dǎo)酶，出現(xiàn)二次生長，使菌體濃度上升。二次生長時由于營養(yǎng)成分不如第一次大量生長時豐富，有害代謝產(chǎn)物濃度也比較高，因此所能達到的最菌體濃度往往比第一次低。而本次實驗中，二次生長達到的最高菌體濃度與第一次相當(dāng)。出現(xiàn)這種情況的原因有兩個：第一，由于顯微鏡出現(xiàn)問題，最后幾次的菌體濃度未能及時測定，產(chǎn)生誤差。第二，在第一次生長的對數(shù)期末停電，供氧中斷。因此，實際的對數(shù)生長期持續(xù)時間可能更長，菌體濃度能達到更高值，但由于缺氧抑制了菌體的繁殖，最終菌體濃度只達到了這個較低的值。3.菌體濃度和OD值哪個更適合作為選取對數(shù)生長期的標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)生長期的選取應(yīng)以活菌數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，但本次實驗所測的數(shù)據(jù)沒有一個可以直接反映活菌數(shù)，只有菌體濃度和OD可以間接反映。這兩個參數(shù)都不能消除死細胞的影響，但OD還同時受菌體大小和裂解后的細胞碎片影響，因此準(zhǔn)確性比菌體濃度低。所以，菌體濃度更適合作為選取對數(shù)生長期的標(biāo)準(zhǔn)。附1：直接滴定法實驗原理樣品加入鹽酸后，糖類水解轉(zhuǎn)化糖，再經(jīng)除去蛋白質(zhì)，在加熱條件下，直接滴定標(biāo)定過的堿性酒石酸銅液，以次甲基藍作指示劑，根據(jù)樣品液消耗體積，計算還原糖量。試劑與設(shè)備堿性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅及0.05g次甲基藍，溶于水中并稀釋至1000ml。堿性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀釋至100ml。10.6%亞鐵氰化鉀溶液。鹽酸、6mol/L鹽酸、20%氫氧化鈉葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取1.000g經(jīng)過98~100℃實驗步驟取100ml樣品置于200ml容量瓶中，加入50ml水，搖勻后再加入6NHCl10ml，在68~70℃標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液：吸取5.0ml堿性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，從滴定管加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2min內(nèi)加熱沸騰，趁沸騰以每兩秒一滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時平行操作三份，取其平均值，計算每10ml(甲、乙液各5ml)堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量(mg)。樣品溶液預(yù)測：吸取5.0ml堿性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時，以每兩秒一滴的速度滴定，直至溶液藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積。樣品溶液測定：吸取5.0ml堿性酒石酸甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，從滴定管加比預(yù)測體積少1ml的樣品溶液，使在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸繼續(xù)以每兩秒一滴，直到藍色剛好褪去終點，記錄樣液消耗體積，同法平行操作三分，得出平均消耗體積。計算X(以葡萄糖計)=（m/V）*200（mg/100ml）式中X——100ml樣品中所含的總糖的mg;m—每10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量(mg)。