實(shí)驗(yàn)四-酵母分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

PAGEPAGE6實(shí)驗(yàn)四酵母分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)一、目的掌握微生物分批培養(yǎng)的生物反應(yīng)器操作；掌握的菌體濃度、總糖等參數(shù)測(cè)定方法；掌握分批培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法。了解酵母的生長(zhǎng)特性。二、原理分批反應(yīng)操作是指基質(zhì)滅菌、接種以后，除了好氧反應(yīng)需要在反應(yīng)過(guò)程中通入無(wú)菌空氣、消除泡沫所用的消泡劑以及維持一定pH值所用酸堿之外，反應(yīng)過(guò)程中不再加入反應(yīng)基質(zhì)?；|(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度以及細(xì)胞濃度均隨反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間而變化，尤其是菌體本身將經(jīng)歷不同的生長(zhǎng)階段（在培養(yǎng)的過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)可分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期），顯示出不同的催化活力?；咎卣魇牵悍磻?yīng)物料一次加入一次卸出；反應(yīng)器物系的組成僅隨時(shí)間而變化，即隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，基質(zhì)的濃度下降，菌體量增加，產(chǎn)物增加。因此它屬于一非穩(wěn)態(tài)過(guò)程。三、主要試劑與設(shè)備酵母、培養(yǎng)基、菲林試劑、0.05NNaOH1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液等100L機(jī)械攪拌式反應(yīng)器、pH計(jì)、離心機(jī)、分光光度計(jì)等四、步驟（一）準(zhǔn)備工作1.發(fā)酵罐的組裝工作（1）連接好冷卻水管。若采用自來(lái)水冷卻，要考慮到白天與夜間水壓的變化，盡可能采用耐壓管，連接部要充分牢固，并且注意連接管管徑與自來(lái)水管管徑應(yīng)一致。（2）由于通人的空氣有一定壓力，應(yīng)注意連接壓縮空氣的管子應(yīng)能承受一定壓力。（3）安裝pH及溶解氧等檢測(cè)裝置，注意各接線口不要出現(xiàn)差錯(cuò)。由于操作過(guò)程要和水打交道，故線路連接一定要注意安全，要特別注意防止漏電。2.種子培養(yǎng)液體試管培養(yǎng)：自斜面菌種挑取一環(huán)酵母菌體，接入裝有10ml10-12oBx無(wú)菌麥芽汁的液體試管中。搖勻，置于30℃三角瓶裝培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)好的液體試管種子接入250m1三角瓶的滅過(guò)菌的10010-12oBx的麥芽汁，接種量10%，30℃3.培養(yǎng)基的配置：按配方配置發(fā)酵罐。培養(yǎng)基的體積通常為罐容積的50-60%。準(zhǔn)確稱量培養(yǎng)基各組分，溶解。一般配置培養(yǎng)基的體積為預(yù)定的70%，因?yàn)闇缇鷷r(shí)，通入的蒸汽發(fā)生冷凝，會(huì)使發(fā)酵液的體積增加。使用合成培養(yǎng)基時(shí)，將糖類及磷酸鹽溶液分別用高壓滅菌鍋滅菌，開始培養(yǎng)前放入發(fā)酵罐內(nèi)，這是為了避免滅菌時(shí)糖類物質(zhì)與氨基化合物反應(yīng)生成褐色物質(zhì)，以及防止磷酸鹽與其它金屬離子生成沉淀。4.發(fā)酵裝置(罐)的清洗發(fā)酵罐使用前后都應(yīng)認(rèn)真清洗，特別是前后兩次培養(yǎng)采用不同的菌株時(shí)，更應(yīng)注意清洗和殺菌工作。發(fā)酵罐有多種型式，罐內(nèi)(可進(jìn)行清洗的)任何部分都應(yīng)認(rèn)真清洗，否則都可能成為雜菌的滋生地。一般認(rèn)為，發(fā)酵前期引起雜染菌的主要原因是由于清洗不凈。易被忽略而未能充分清洗的地方有噴嘴內(nèi)部與取樣管內(nèi)以及罐頂?shù)忍帯Ａ硗?，還應(yīng)充分注意發(fā)酵罐周圍的附件設(shè)備，如加熱器、電機(jī)等的安全使用。5.電極的標(biāo)定對(duì)pH電極和溶氧電極進(jìn)行零點(diǎn)校正和斜率校正。6.參數(shù)的控制及設(shè)定根據(jù)發(fā)酵要求在操作面板或反應(yīng)器應(yīng)用程序上進(jìn)行設(shè)定。發(fā)酵控制參數(shù)值如下：溫度30℃時(shí)間48h,空氣流量——（三）發(fā)酵罐發(fā)酵步驟如下：清洗→空消→實(shí)消→冷卻→接種→發(fā)酵→取樣→放罐1.蒸汽的產(chǎn)生打開蒸汽發(fā)生器進(jìn)水閥和放氣閥，加水至水位上限，關(guān)閉進(jìn)水閥和放氣閥。啟動(dòng)蒸汽發(fā)生器電源開關(guān)加熱至0.40MPa左右。2.空消空氣過(guò)濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免實(shí)消罐中物料沖入過(guò)濾器內(nèi)；通蒸汽前檢反應(yīng)器所有閥門是否關(guān)閉。打開蒸汽發(fā)生器排冷凝水的閥門，排放冷凝水至蒸汽出現(xiàn)，關(guān)閉此閥門；然后打開蒸汽發(fā)生器供給反應(yīng)器蒸汽的閥門。進(jìn)蒸汽順著蒸汽管路開閥門，蒸汽為活汽。打開罐頂排氣，先對(duì)空氣過(guò)濾系統(tǒng)滅菌，順著氣路開閥，再開尾閥排冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥，保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓；再進(jìn)罐體，蒸汽分三路進(jìn)罐，先主管道，后次管道；蒸汽也按以上規(guī)則順行進(jìn)路徑開閥，先開支路閥，再開排汽閥，最后為進(jìn)罐閥。罐壓升至0.12MPa(此時(shí)控制系統(tǒng)中溫度讀數(shù)約為120℃左右)時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅菌30min。滅菌時(shí)，保持各閥排氣通暢，防止存在死角。滅菌結(jié)束時(shí)，逆著進(jìn)路關(guān)閥門?？諝膺^(guò)濾系統(tǒng)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥，完成；進(jìn)罐蒸汽管路先關(guān)進(jìn)汽閥，再排汽閥，最后為支路閥。但空消一結(jié)束，即要通入無(wú)菌空氣吹干空氣過(guò)濾系統(tǒng)管路并保壓，避免染菌。打開罐頂排汽閥直至表壓為零，再通過(guò)罐底排空罐里的冷凝水。注：粗過(guò)濾器不空消也不實(shí)消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過(guò)濾器的閥門。3.實(shí)消將pH電極和溶氧電極裝上，懸緊螺旋。打開進(jìn)料口進(jìn)料。進(jìn)料完成后，向夾套中通入蒸汽將發(fā)酵液加熱至80℃以上，關(guān)閉蒸汽閥門。隨后向發(fā)酵液通入蒸汽至0.12MPa4.冷卻：滅菌結(jié)束后，立即打開冷卻水（下進(jìn)上出）至30℃5.接種、發(fā)酵：適當(dāng)降低通風(fēng)量，使高壓接近零。在接種口（進(jìn)料口）周圍放置浸有酒精的棉花，點(diǎn)燃后迅速打開接種口，將菌種加入到發(fā)酵罐中，旋緊接種口蓋子，熄滅火焰，調(diào)節(jié)通風(fēng)量，接上玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)，使流量計(jì)讀數(shù)在8.0左右，同時(shí)保持罐壓0.04Mpa，保溫保壓發(fā)酵48hr6.取樣培養(yǎng)基放入罐前取50ml，測(cè)定其還原糖，菌體量。發(fā)酵每隔4h后取樣100m測(cè)定菌體量、總還原糖。取樣時(shí)，將取樣口最初的10ml培養(yǎng)液棄掉。具體操作如下：須提前半小時(shí)，開啟蒸汽發(fā)生器，送入蒸汽，開啟閥門1，2，蒸汽滅菌。半小時(shí)后，關(guān)閥門1，立即開啟閥門3，先放棄部分培養(yǎng)液，再取樣100ml左右至滅菌三角瓶中（標(biāo)注好取樣日期、時(shí)間、取樣人），冷藏備測(cè)。關(guān)閉閥門3，開啟閥門1，半小時(shí)后關(guān)閉閥門2，再關(guān)閥門1。7.放罐：培養(yǎng)完成時(shí)，除取出足夠量的培養(yǎng)液作為樣品外，剩余培養(yǎng)液要經(jīng)過(guò)殺菌處理。此時(shí)發(fā)酵罐所裝有的電極可一同經(jīng)殺菌處理。如果培養(yǎng)液為無(wú)害物質(zhì)，可將電極單獨(dú)取出處理，以利于延長(zhǎng)電極使用壽命。殺菌完成后，溫度降低到一定溫度時(shí)，取出電極，將殺菌后培養(yǎng)液丟棄到指定地點(diǎn)。一般培養(yǎng)液溫度較高時(shí)，有難聞氣味產(chǎn)生，因此，排放溫度應(yīng)盡可能低一些。8.清洗：空罐后，加大排氣，使表壓掉零，取出各探頭，加蓋，由進(jìn)料口加入凈水關(guān)好，罐內(nèi)升壓，放罐，如此重復(fù)兩次。清洗、空消、實(shí)消、冷卻操作完全一致；五、記錄、數(shù)據(jù)處理測(cè)定方法：1.菌體濃度測(cè)定：將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，在660nm，波長(zhǎng)下測(cè)其濁度，同時(shí)采用血球記數(shù)。2.還原糖測(cè)定方法：采用菲林法測(cè)定。記錄：數(shù)據(jù)采集：系統(tǒng)自動(dòng)采集，每2min采集一組數(shù)據(jù)并存貯，包括：溫度、溶氧、pH、等，系統(tǒng)可自動(dòng)給出有關(guān)曲線。同時(shí)由值班者每30min記錄一次，準(zhǔn)確填表，獲取數(shù)據(jù)制作過(guò)程曲線。值班人員做好記錄，發(fā)酵罐每隔4h取樣。按表1記錄。表1酵母發(fā)酵批報(bào)罐批1接種時(shí)間14:26放罐時(shí)間取樣時(shí)間14:4419:2022:3001：2004：2007：2015：24培養(yǎng)時(shí)間/h0.304.908.0710.9013.9016.9024.97pH6.075.935.44.934.474.494.11罐溫℃33.9030.2031.1031.1031.7032.0032.40OD0.9430.8831.2501.3601.5161.5141.880菌體濃度/（個(gè)/1.00E-4mL）71055510701290178050785250還原糖/(mg/100mL)268824442067192016801519840取樣時(shí)間18：2421：2800：2803：2806：2809：2811：18培養(yǎng)時(shí)間/h27.9731.0334.0337.0340.0343.0344.87pH3.953.913.813.753.883.853.84罐溫℃31.5030.2031.7032.0031.8032.00OD1.9921.9274.8324.5723.9164.4684.468菌體濃度/（個(gè)/1.00E-4mL）5550530047202940104034005380還原糖/(mg/100mL)67243027221379.552.544.6（三）以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體濃度、還原糖%、pH、OD為縱坐標(biāo)作圖，觀察各參數(shù)的變化。采用計(jì)算機(jī)擬和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的動(dòng)力學(xué)方程。圖1菌體濃度-t圖圖2還原糖-t圖圖3pH-t圖圖4OD-t圖由圖1可看出，22:30-07：20為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期部分?jǐn)?shù)據(jù)表取樣時(shí)間19:2022:3001：2004：2007：20培養(yǎng)時(shí)間/h4.908.0710.9013.9016.90OD0.8831.2501.3601.5161.514菌體濃度/（個(gè)/1.00E-4mL）5551070129017805078還原糖/(mg/100mL)24442067192016801519pH5.935.44.934.474.49t-t'03.176.009.0012.00In(X/X')00.6560.8431.1652.214注：t為培養(yǎng)時(shí)間/h，X為菌體量/（個(gè)/1.00E-4mL）。t’X’為19：20時(shí)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間和菌體濃度，t’=4.90，X’=555（個(gè)/1.00E-4mL）圖5以菌體數(shù)量擬合對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)方程所以，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)方程：dX/dt=0.1701X（四）用圖示表示比生長(zhǎng)速率[μ=(dX/dt)/X隨時(shí)間變化趨勢(shì)。培養(yǎng)時(shí)間/h0.304.908.0710.9013.9016.9024.97菌體量/（1.00E-4mL）71055510701290178050785250μ-0.05350.2070.06610.1070.3490.00413培養(yǎng)時(shí)間/h27.9731.0334.0337.0340.0343.0344.87菌體量/（1.00E-4mL）5550530047202940104034005380μ0.0185-0.0151-0.0386-0.158-0.3460.3950.249t為取樣時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，t’為前一次取樣時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間X為取樣時(shí)的菌體濃度，X’為前一次取樣時(shí)的菌體濃度μ=In(X/X’)/(t-t’)μ為t-t’時(shí)代平均比生長(zhǎng)速率圖6比生長(zhǎng)速率圖六、思考題：空消時(shí)，應(yīng)注意什么？（1）空消時(shí)，一定要排盡發(fā)酵罐夾套內(nèi)的余水。否則可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)筒體壓扁，造成設(shè)備損壞。

（2）設(shè)備初次使用或長(zhǎng)期不用后啟動(dòng)時(shí)，最好采用間歇空消，以便消除芽孢。（3）空氣過(guò)濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免實(shí)消罐中物料沖入過(guò)濾器內(nèi)；粗過(guò)濾器不空消也不實(shí)消。（4）除菌過(guò)濾器的濾芯不能承受高溫高壓，因此，蒸汽減壓閥必須調(diào)整在0.13Mpa，不能超過(guò)0.15Mpa（關(guān)于兩個(gè)壓力值，從不同的地方查到的數(shù)據(jù)相互間有出入，具體可根據(jù)設(shè)備而異）。（5）空消時(shí)開尾閥排冷凝水，排掉冷空氣，保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。（6）空消時(shí)，溶氧電極，pH電極取出，可以延長(zhǎng)使用壽命。（7）空消一結(jié)束，即要通入無(wú)菌空氣吹干空氣過(guò)濾系統(tǒng)管路并保壓，避免染菌。微生物接種一般接種方法有幾種？（1）火焰接種法：在接種口用酒精火圈消毒，然后打開接種口蓋，迅速將接種液倒入罐內(nèi)，在把蓋擰緊。（2）差壓法：在滅菌前放入墊片，接種時(shí)把接種口蓋打開，先倒入一定量的酒精消毒。待片刻后把種液瓶的針頭插入接種口的墊片。利用罐內(nèi)壓力和種液瓶?jī)?nèi)的壓力差，將種液引入罐內(nèi)，擰緊蓋子。配置培養(yǎng)基應(yīng)注意什么？（1）一般配置培養(yǎng)基的體積為預(yù)定的70%，因?yàn)闇缇鷷r(shí)，通入的蒸汽發(fā)生冷凝，會(huì)使發(fā)酵液的體積增加。（2）使用合成培養(yǎng)基時(shí)，將糖類及磷酸鹽溶液分別用高壓滅菌鍋滅菌，開始培養(yǎng)前放入發(fā)酵罐內(nèi)，這是為了避免滅菌時(shí)糖類物質(zhì)與氨基化合物反應(yīng)生成褐色物質(zhì)，以及防止磷酸鹽與其它金屬離子生成沉淀。七、分析討論：1.關(guān)于OD值與菌體量變化的分析比較表3OD值與菌體量變化比較表取樣時(shí)間14:4419:2022:3001：2004：2007：2015：24OD0.9430.8831.2501.3601.5161.5141.880菌體濃度/（個(gè)/1.00E-7mL）0.7100.5551.0701.2901.7805.0785.250對(duì)應(yīng)圖6中編號(hào)1234567取樣時(shí)間18：2421：2800：2803：2806：2809：2811：18OD1.9921.9274.8324.5723.9164.4684.468菌體濃度/（個(gè)/1.00E-7mL）5.5505.3004.7202.9401.0403.4005.380對(duì)應(yīng)圖6中編號(hào)891011121314圖6OD值與菌體量變化比較圖圖中虛線為菌體濃度變化，實(shí)線為OD值變化由圖可看出，在第6至9個(gè)點(diǎn)（即07：20-21：28）段OD值與菌體濃度變化趨勢(shì)相差較大?？赡茉蚴牵壕w濃度在5-6間（04：20-07：20）迅速積累，細(xì)胞的增殖速度超過(guò)細(xì)胞物質(zhì)的合成速度，導(dǎo)致分裂后的菌體體積減小，相同菌體濃度的吸光度下降，所以O(shè)D值并不立即隨菌濃度量上升而上升。直到9-10段（21：28-00：28）菌體合成大量細(xì)胞物質(zhì)使吸光度上升。但OD值相對(duì)菌體濃度變化的滯后一般不會(huì)太長(zhǎng)，而本次實(shí)驗(yàn)中則滯后了約17h。這可能是因?yàn)樵?8：10-14：24間斷電，停止通氧導(dǎo)致菌體代謝減慢，在從新開始供氧后菌體又需要一段時(shí)間適應(yīng)環(huán)境變化，恢復(fù)代謝，從而導(dǎo)致OD值對(duì)菌體濃度滯后時(shí)間長(zhǎng)。另外，在缺氧時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)某些代謝產(chǎn)物積累，影響之后的菌體代謝，這也會(huì)延長(zhǎng)OD值對(duì)菌體濃度的滯后時(shí)間。在第10至14個(gè)點(diǎn)（即00：28-11：18）段OD值變化趨勢(shì)與菌體濃度相同，但變化程度菌體濃度遠(yuǎn)大于OD值?？赡茉蚴牵壕w裂解后的細(xì)胞碎片的干擾導(dǎo)致測(cè)得的OD值偏大。2.菌體濃度在06：28-11：18時(shí)間段上升到原因?qū)嶒?yàn)使用的培養(yǎng)基中除葡萄糖外還還有大量其它糖類，當(dāng)葡萄糖被消耗完后菌體大量死亡，但也有部分菌合成利用其它糖類的誘導(dǎo)酶，出現(xiàn)二次生長(zhǎng)，使菌體濃度上升。二次生長(zhǎng)時(shí)由于營(yíng)養(yǎng)成分不如第一次大量生長(zhǎng)時(shí)豐富，有害代謝產(chǎn)物濃度也比較高，因此所能達(dá)到的最菌體濃度往往比第一次低。而本次實(shí)驗(yàn)中，二次生長(zhǎng)達(dá)到的最高菌體濃度與第一次相當(dāng)。出現(xiàn)這種情況的原因有兩個(gè)：第一，由于顯微鏡出現(xiàn)問(wèn)題，最后幾次的菌體濃度未能及時(shí)測(cè)定，產(chǎn)生誤差。第二，在第一次生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期末停電，供氧中斷。因此，實(shí)際的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)時(shí)間可能更長(zhǎng)，菌體濃度能達(dá)到更高值，但由于缺氧抑制了菌體的繁殖，最終菌體濃度只達(dá)到了這個(gè)較低的值。3.菌體濃度和OD值哪個(gè)更適合作為選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的選取應(yīng)以活菌數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，但本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)的數(shù)據(jù)沒有一個(gè)可以直接反映活菌數(shù)，只有菌體濃度和OD可以間接反映。這兩個(gè)參數(shù)都不能消除死細(xì)胞的影響，但OD還同時(shí)受菌體大小和裂解后的細(xì)胞碎片影響，因此準(zhǔn)確性比菌體濃度低。所以，菌體濃度更適合作為選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的標(biāo)準(zhǔn)。附1：直接滴定法實(shí)驗(yàn)原理樣品加入鹽酸后，糖類水解轉(zhuǎn)化糖，再經(jīng)除去蛋白質(zhì)，在加熱條件下，直接滴定標(biāo)定過(guò)的堿性酒石酸銅液，以次甲基藍(lán)作指示劑，根據(jù)樣品液消耗體積，計(jì)算還原糖量。試劑與設(shè)備堿性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅及0.05g次甲基藍(lán)，溶于水中并稀釋至1000ml。堿性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶?jī)?nèi)。乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀釋至100ml。10.6%亞鐵氰化鉀溶液。鹽酸、6mol/L鹽酸、20%氫氧化鈉葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取1.000g經(jīng)過(guò)98~100℃實(shí)驗(yàn)步驟取100ml樣品置于200ml容量瓶中，加入50ml水，搖勻后再加入6NHCl10ml，在68~70℃標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液：吸取5.0ml堿性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，從滴定管加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2min內(nèi)加熱沸騰，趁沸騰以每?jī)擅胍坏蔚乃俣壤^續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時(shí)平行操作三份，取其平均值，計(jì)算每10ml(甲、乙液各5ml)堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量(mg)。樣品溶液預(yù)測(cè)：吸取5.0ml堿性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時(shí)，以每?jī)擅胍坏蔚乃俣鹊味?，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。樣品溶液測(cè)定：吸取5.0ml堿性酒石酸甲液及5.0ml乙液，置于150ml錐形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠兩粒，從滴定管加比預(yù)測(cè)體積少1ml的樣品溶液，使在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸繼續(xù)以每?jī)擅胍坏危钡剿{(lán)色剛好褪去終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積，同法平行操作三分，得出平均消耗體積。計(jì)算X(以葡萄糖計(jì))=（m/V）*200（mg/100ml）式中X——100ml樣品中所含的總糖的mg;m—每10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量(mg)。