【課件】基因工程的基本操作程序+課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第二節(jié)基因工程的基本操作程序人教版高中生物學(xué)教材《生物技術(shù)與工程》（選擇性必修三）第三章問題探討蘇云金桿菌培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉需要哪幾步？Bt基因表達(dá)蘇云金伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）攝食害蟲死亡蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程問題探討基因工程的基本操作程序（4個(gè)步驟）1234目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取一、目的基因（1）概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。（Bt抗蟲蛋白基因：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因（2）實(shí)例：目的基因的篩選與獲取二、篩選合適的目的基因方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。DNA測序儀核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)美國國家生物信息中心越來越多基因的功能和結(jié)構(gòu)被分析。PCR技術(shù)：PCR是__________________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)________________的原理，在______提供參與DNA復(fù)制的__________與____________，對(duì)_______________________進(jìn)行___________的技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制特異性地快速擴(kuò)增目的基因原理操作環(huán)境目的優(yōu)點(diǎn)：目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補(bǔ)配對(duì)短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物子鏈延伸子鏈延伸PCR條件耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶PCR條件3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí),雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’PCR過程5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考：

1.PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？PCR過程思考：2.PCR技術(shù)最終哪部分被大量復(fù)制了？引物對(duì)之間的部分3’5’5’3’5’5’3’3’思考：3.PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循哪些原則？引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列等思考：4.一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），通過PCR擴(kuò)增n次：

復(fù)制過程中共需引物__________個(gè)2n＋1-2PCR過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建一、基因表達(dá)載體的目的（1）？（2）？二、基因表達(dá)載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)?；虻纳嫌危ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）人們所需要的基因位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種培育抗蟲棉的簡要過程使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？問題探討選擇用2種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割，減少自身環(huán)化的情況。載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1培育抗蟲棉的簡要過程

閱讀81-82頁，思考下列問題：1.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)分別采用哪些方法？①植物細(xì)胞②動(dòng)物細(xì)胞②微生物細(xì)胞2.目的基因的檢測與鑒定包括哪些水平的鑒定？具體做法分別是？將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——Ca2+轉(zhuǎn)化法顯微注射法（1）花粉管通道法（我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1.什么是轉(zhuǎn)化？2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用了農(nóng)桿菌哪些特點(diǎn)。3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中涉及到幾次DNA的拼接和幾次導(dǎo)入？（可轉(zhuǎn)移的DNA）關(guān)于農(nóng)桿菌培育抗蟲棉的簡要過程

閱讀81-82頁，思考下列問題：1.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)分別采用哪些方法？①植物細(xì)胞②動(dòng)物細(xì)胞②微生物細(xì)胞2.目的基因的檢測與鑒定包括哪些水平的鑒定？具體做法分別是？1.基因工程的基本操作程序（4個(gè)步驟）,核心步驟？2.利用基因工程的培育抗蟲棉，抗蟲基因來自于？3.篩選目的基因較為有效的方法是？人們通過哪些技術(shù)研究基因的結(jié)構(gòu)和功能？4.PCR的全稱、原理、操作環(huán)境、優(yōu)點(diǎn)、條件分別是？5.PCR每次循環(huán)分為哪3步？對(duì)應(yīng)溫度及具體過程分別是？鑒定PCR產(chǎn)物的技術(shù)是？6.構(gòu)建基因表達(dá)載體的2個(gè)目的？7.基因表達(dá)載體必須包含哪些結(jié)構(gòu)？啟動(dòng)子、終止子的位置和功能分別是？8.怎樣避免質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化？9.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有哪些？10.花粉管通道法的兩種操作分別是？11.轉(zhuǎn)化的概念？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用了農(nóng)桿菌的哪些特點(diǎn)？整個(gè)過程進(jìn)行了幾次DNA的拼接？幾次導(dǎo)入？12.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、原核生物的具體方法分別是？13.在分子水平對(duì)目的基因檢測與鑒定的方法有哪些？還需要進(jìn)行什么水平的鑒定？14.PCR的原理？步驟？離心的目的？預(yù)變性的目的？15.鑒定PCR產(chǎn)物的方法？鑒定原理？加樣時(shí)，留兩個(gè)孔，分別加入什么物質(zhì)？分別有什么目的？16.怎樣避免外來DNA的污染？緩沖液和酶怎樣保存？怎樣解凍？第二節(jié)基因工程的基本操作程序2人教版高中生物學(xué)教材《生物技術(shù)與工程》（選擇性必修三）第三章探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動(dòng)調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復(fù)制變性90?C延伸72?C復(fù)性50?C2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在_____的作用下，這些________會(huì)向著________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是_____；可解離的基團(tuán)pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。凝膠電泳原理示意圖二、材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定一次性吸液槍頭10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水。(離心管)⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等二、材料用具DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定注：模板DNA的用量為1pg-1ug使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合三、方法步驟DNA片段的擴(kuò)增用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1minDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定PCR技術(shù)移液離心擴(kuò)增DNA片段的電泳鑒定

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。三、方法步驟DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相DNA片段的電泳鑒定三、方法步驟DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定加樣電泳觀察1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。特別注意DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?/p>

如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定第二節(jié)基因工程的基本操作程序3人教版高中生物學(xué)教材《生物技術(shù)與工程》（選擇性必修三）第三章實(shí)驗(yàn)：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定PCR儀DNA分子電泳1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動(dòng)調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復(fù)制變性90?C延伸72?C復(fù)性50?C2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在_____的作用下，這些________會(huì)向著________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是_____；可解離的基團(tuán)pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關(guān)③凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象凝膠電泳原理示意圖1.儀器2.材料PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等微量離心管微量移液器電泳裝置PCR儀10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL3.PCR反應(yīng)體系的配方注：模板DNA的用量為1pg-1ug使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min移液離心擴(kuò)增1.DNA片段的擴(kuò)增配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相2.DNA片段的電泳鑒定2.DNA片段的電泳鑒定1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。注意1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?/p>

如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因？新冠病毒核酸檢測

(2022·天津一中高二期中)下