基因修飾生物學(xué)特性及免疫調(diào)控作用研究

縮略詞ethanesulfonicN-2．羥乙基哌嗪-N’，2一乙hydroxyethylgrowth次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基hypoxanthinephosphofibosyl-異丁基甲基黃嘌L-L—L．谷氨酰分mixedlymphoc”es混合淋巴細(xì)胞反M_M莫洛尼氏鼠白血病感染強(qiáng)stern縮略詞ethanesulfonicN-2．羥乙基哌嗪-N’，2一乙hydroxyethylgrowth次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基hypoxanthinephosphofibosyl-異丁基甲基黃嘌L-L—L．谷氨酰分mixedlymphoc”es混合淋巴細(xì)胞反M_M莫洛尼氏鼠白血病感染強(qiáng)stern間充質(zhì)干humanstem人間充質(zhì)mousemesenchymalstem小鼠間充質(zhì)干細(xì)thiazolyl噻唑optical光密osteogenic骨分化添plaqueforming噬斑形成外周血淋磷酸鹽緩沖碘化丙P—磷酸對硝基苯酚二鈉p“。5i87。p1‘‘8“‘。rs‘8?！啊薄?。8”e1)衄氧化增子的，22rotationperribonucleie核糖核RT-chain逆轉(zhuǎn)錄reverse訂秒干細(xì)胞抗原stemcellantigen-scarer擴(kuò)散因三羥甲基氨基甲Tyrode’sBSSTyrode’sbalancedsaltTyrode’s平衡鹽溶TGF-transforminggrowthfactor—轉(zhuǎn)化生長因子中文摘HGF基因修飾的MSC生物學(xué)特性及免疫摘間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcell，MSC)可通過細(xì)胞中文摘HGF基因修飾的MSC生物學(xué)特性及免疫摘間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcell，MSC)可通過細(xì)胞間作用及分泌細(xì)因子(HGF、TGF．B等)抑制淋巴細(xì)胞增殖，與造血于細(xì)胞共移植能夠減低的發(fā)生。肝細(xì)胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)在小鼠異基因骨髓植模型中具有免疫抑制和修復(fù)損傷作用，從多環(huán)節(jié)減輕GVHD的發(fā)生，同時(shí)保GVL效應(yīng)。為明確MSC和HGF基因兩者聯(lián)合是否具有免疫協(xié)同效應(yīng)，我們開YHGF基因修飾MSC免疫調(diào)控作用的研究。期望為HGF基因修飾骨髓間充質(zhì)干胞防治GVHD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)我們利用Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增人骨髓來源的MSC，化后骨片培養(yǎng)的方法分離純化小鼠骨來源的MSC。上述細(xì)胞均呈貼壁生長的成維細(xì)胞樣形態(tài)，表型特征分析顯示細(xì)胞為非造血非內(nèi)皮細(xì)胞群，分化試驗(yàn)證明胞具有體外成骨和成脂肪能力，說明獲得的細(xì)胞符合MSC的確認(rèn)“標(biāo)準(zhǔn)”在此基礎(chǔ)上，我們觀察了HGF基因轉(zhuǎn)染對MSC生物學(xué)特性的影響。首先，用攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad．GFP)感染MSC，以GFP為報(bào)告基因，確了重組腺病毒對MSC的感染效率。流式檢測結(jié)果表明，腺病毒感染強(qiáng)度MOI為時(shí)，感染效率幾乎達(dá)到了100％；我們利用相同MOI的Ad。HGF感染MSC，用法檢測HGF的分泌表達(dá)，結(jié)果表明感染后HGF可在短期內(nèi)高效表達(dá)。提示腺病可以有效介導(dǎo)HGF在MSC中表達(dá)為確定HGF基因轉(zhuǎn)染對MSC生物學(xué)特性的影響，我們檢測了轉(zhuǎn)HGF基MSC(MSC—HGF)的細(xì)胞表型，結(jié)果表明轉(zhuǎn)HGF基因不影響MSC表型基因細(xì)胞相似，MSC—HGF仍表達(dá)CD29、CD73、CDl05、CDl66和不表達(dá)CD3l、CD34、CD45以及HLA—DR。我們進(jìn)一步檢測了MSC—HGF的分性能，誘導(dǎo)脂肪分化后油紅。染色顯示MSC．HGF體外成脂肪能力正常；誘導(dǎo)骨分化后進(jìn)行ALP活性染色和定量以及Ca沉積定量均表明MSC．HGF成骨能力；用地塞米松誘導(dǎo)后，在mRNA水平檢測到成骨、脂肪和軟骨分化相基因的表達(dá)；另外，不誘導(dǎo)時(shí)MSC-HGF與MSC成骨、成軟骨和成脂肪標(biāo)志分表達(dá)無差異，說明HGF基因修飾本身不引起間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并且不影響4中文摘體外多向分化潛能，從以上兩方面可以認(rèn)定中文摘體外多向分化潛能，從以上兩方面可以認(rèn)定HGF基因修飾不改變MSC固有MSC表達(dá)HGF受體C．Met。我們研究表明重組HGF可以明顯誘導(dǎo)MSC的遷移而且存在劑量依賴關(guān)系。應(yīng)用低血清饑餓的細(xì)胞損傷模型，我們觀察到進(jìn)入S期的細(xì)胞百分比明顯高于對照組，說明HGF基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)MSC在低血境中的存活能力，表明MSC—HGF自分泌HGF有可能調(diào)節(jié)Msc的歸巢我們進(jìn)一步觀察了MSC．HGF在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)作用。在體外混合淋巴應(yīng)中，MSC。HGF可顯著抑制由異基因淋巴細(xì)胞或有絲分裂原刺激引起的淋巴胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，與MSC組間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明基因修飾顯著增強(qiáng)MSC體外免疫抑制功能。在此基礎(chǔ)上，我們按5×105cells／只雌性C57BU6J的MSC．HGF(或者M(jìn)SC)由尾靜脈輸注至BALB／c受體小鼠體內(nèi)之后建立異基因小鼠 rBALB／c)皮膚移植模型，以評價(jià)MSC—HGF內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果證實(shí)：與MSC組比較，MSC—HGF輸注可以明顯延長異基因皮膚移植物存活時(shí)間；組織病理分析也提示MSC—HGF減輕了異基因免反應(yīng)引起的病理變化，對組織有一定的保護(hù)作用，上述結(jié)果表明MSC—HGF可制體內(nèi)正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)過程，從而促進(jìn)移植皮膚存活和減輕病理損害通過以上結(jié)果，可以得出：1)HGF基因轉(zhuǎn)染MSC功能特性；2)HGF基因修飾可增強(qiáng)MSC抵抗低血清損傷的能力，促進(jìn)細(xì)胞活及歸巢；3)轉(zhuǎn)染HGF基因的MSC在體內(nèi)外具有免疫抑制作用。本研究為基因修飾MSC在干細(xì)胞移植和免疫疾病中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞，肝細(xì)胞生長因子，腺病毒載體，免疫調(diào)節(jié)，混合淋巴胞反應(yīng)，異基因皮膚移英文摘studiesoncharacteristicsstemcellsactivitiesfactorhepatocyteproliferationdirectcell—cellcontactcytokinesecretion．Theco—ofculturedandtreatmentandstemcellsispotentiallyfortheGVHD．Previousdatahavealsodemonstratedhepatocytepeliotropiccytokineofmesenchymaloriginpromotingsurvivalinacells．Thus，HGFthematurationintodevelopmentthymus英文摘studiesoncharacteristicsstemcellsactivitiesfactorhepatocyteproliferationdirectcell—cellcontactcytokinesecretion．Theco—ofculturedandtreatmentandstemcellsispotentiallyfortheGVHD．Previousdatahavealsodemonstratedhepatocytepeliotropiccytokineofmesenchymaloriginpromotingsurvivalinacells．Thus，HGFthematurationintodevelopmentthymusinhibitalloimmunereactioninthealleviationofseveritywhile andidentifyiftheimmuneeffectofGVLinvestigatedfunctionofAd—behaviorMSC—ofof thestrategy．Then，wefunctionMSC—HGFbotll加vitroandinvivo．TheresultsshowedthatMSC—HGFexhibitthanMSConsuppressivecellularimportantly,MSC—survival MSCthe(C57--MSC—HGFincontrollinginthesettingsofallogeneicmarrowwereisolatedMSCandgradientculture—expandedadherencetoplasticflasks．MousecompactbonederivedweregainedIIdigestedbonecollagenasethemselvesasfibroblast-likecytometric6英文摘cellstheabilityinadipogenesis，revealingthatthecellsgainedbythesemethodsmeetthewell-criteriaforMSCefficiencyoftransfectionbytheadenovirusvectorwasassessedandWas GFPasamountof Ad—HG-modifiedMSCevaluatedwithELISA．TheresultSindicatedthatefficiencyto100％whentheM01英文摘cellstheabilityinadipogenesis，revealingthatthecellsgainedbythesemethodsmeetthewell-criteriaforMSCefficiencyoftransfectionbytheadenovirusvectorwasassessedandWas GFPasamountof Ad—HG-modifiedMSCevaluatedwithELISA．TheresultSindicatedthatefficiencyto100％whentheM01wasinfection．Thus，Ad-toinfectisover-expressedofMSCinfectedbyAd—HGFFurther,thebiologicalindicatedthathumanMSC—HGFincytometry CD29，CD73，CDl05，CDl66，HLA—ABCandCD45wassimilartothatofHLA—profileoftransfectedcellswasunaffected．InvitrodifferentiationthathumanMSC—HGFcouldbeinducedrevealedbyOilRedinofcellularanddepositionextracellularMSC—possessmRNAlevelschondrogeneic—relateddetectedafterdexumethasonetreatment．TheresultsdemonstratedthatofMSC—HGFwerethesameasthosegeneCannotinduceAD—HGFtodifferentiateandthedifferentiationthistreatmenthaslittleoftheintrinsicfeaturesofMSCwereunaffectedbyAd—HGFFurthermore，trans—migrationMSCtomigrateindose-dependentmanner．And，whenMSC-HGFMSCtolow-ofMSC—HGFinstarvation，themarkedlyhie3erthanthatofprotectthatHGFisable7英文摘injuryelicitedbylownutrientofMSC—invitro．MSCimmunoregulatoryLater,weMSC-- concentrationswereCO·-culturedsimultaneouslystimulatedbyallogeneiclymphocytesmononuclearcellswas3H-non—specificmitogen，ConA．LymphocyteshowedthatMSC-HGFcouldexhibitincorporationassay．Theofdose—functionof英文摘injuryelicitedbylownutrientofMSC—invitro．MSCimmunoregulatoryLater,weMSC-- concentrationswereCO·-culturedsimultaneouslystimulatedbyallogeneiclymphocytesmononuclearcellswas3H-non—specificmitogen，ConA．LymphocyteshowedthatMSC-HGFcouldexhibitincorporationassay．Theofdose—functionofMSC—HGFenhancementthereof,sex-matchedtail—skingraftingwasconductedinamousemodeltoobserveMSC—HGFcouldinvivo．Full—thicknesstail—(around0．5×0．5cm2)fromC57／BL(allo—grafting)orBALB／c(syngeneicwhichanwastransferredtothesidesoftherecipient’Samountskinhadbeenremoved．MSC．HGFfemaleC57／BLresultsdemonstratedBALB／cthesurvivalMSC—HGFtreatmentofofexaminationconfirmedMSC—HGFCanalleviatepathologicalchangesproducedbyt11atMSC—response．Thesefindingsstronglymightdown—regulateimmuneresponseprocessinstudies frominjuriescausedbyserurumodificationprotectsMSCmigrationthatmayresultinthechemotaxisintothesitesoftissuedamagevitro ofMSCbothenhancesimmunomodulatoryfindingsmightprovidenovelcuesfortheontheapplicationofMSCandimmune-relatedstemseRingsKeywords：mesenchymalgrowthfactor，adenovirus8日吾日舌異基因造血干細(xì)胞移植已成為治愈多種造血和非造血系統(tǒng)良、惡性日吾日舌異基因造血干細(xì)胞移植已成為治愈多種造血和非造血系統(tǒng)良、惡性疾病以versus自身免疫性疾病主要的治療手段，但是，移植物抗宿主病Disease，GVHD)是影響移植效果及長期存活率的主要因素，即使在HLA相合骨髓移植病例中發(fā)生率也高達(dá)40％一85％。國內(nèi)外學(xué)者不斷探索防治GVHD徑，其中間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcell，MSC)的應(yīng)用是一個(gè)新方向MSC具有低免疫原性和較低的抗原遞呈能力【1。31。在體外，MSC能夠不明，MSC在體內(nèi)能夠逃脫異基因反應(yīng)性T細(xì)胞的識別【4、5】。給狒狒輸注6x107MSC并同時(shí)進(jìn)行異基因皮膚移植，MSC膚的存活時(shí)間，表明MSC對活體內(nèi)的同種異基因反應(yīng)同樣具有抑制作用【6】，并MSC的抑制效應(yīng)與細(xì)胞來源無關(guān)，除了來自供、受者之外，包括第三者同種異MSC或異種MSC均能延長皮膚移植物存活時(shí)間[_MSC免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制還未完全闡明，但是相關(guān)研究結(jié)論大致包括以下幾方面。Krampera等[8]關(guān)于Msc作用的體外研究認(rèn)為MSC通過細(xì)胞間相互接觸，非同源的方式阻止T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞(APCs)接觸，同時(shí)抑制幼稚T細(xì)胞和抗原特異性記憶T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。在靜脈輸注MSC之后進(jìn)行的植研究中，MSC能夠通過與細(xì)胞的直接作用阻止APCs的成熟，誘導(dǎo)T細(xì)胞對異因抗原的無反應(yīng)性，抑制由APCs間接介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答，誘導(dǎo)移植物耐受【9、10】另外，MSC自身可以對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cTL)前體細(xì)胞表面抗原發(fā)生作從而抑制其功能【ll】。DiNicola等㈦提／iIMSC通過分泌可溶性分子如HGF、以及MSC間接觸，對T細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而且MSC量越多抑制效果越強(qiáng)多項(xiàng)研究已經(jīng)考察了MSC潛在的治療性應(yīng)用價(jià)值。動物實(shí)驗(yàn)證明，MSC造血干細(xì)胞共移植具有促進(jìn)植入和阻止GVHD的作用[”】，為臨床實(shí)驗(yàn)提供了理依據(jù)。臨床研究初期結(jié)果來自于接受第三者M(jìn)SC移植的一小組病人，盡管在造恢復(fù)方面沒有改善，但是患者生存率提高【14】。LeBlanc等【15】相合MSC治療一例重度(IV度)aGVHD的9歲男性患者，該病例常規(guī)免疫抑治療無效，MSC輸注后患者的GVHD癥狀及相關(guān)病理表現(xiàn)顯著改善，并且在移后1年內(nèi)保持這種狀況。在一個(gè)I—II期臨床研究中心的報(bào)道中，36名接受HSC9日舌骨髓MSC(1．0—2．5x106／kg體重)共移植同時(shí)應(yīng)用CSA和MTX進(jìn)行GVHD預(yù)防日舌骨髓MSC(1．0—2．5x106／kg體重)共移植同時(shí)應(yīng)用CSA和MTX進(jìn)行GVHD預(yù)防血液系統(tǒng)腫瘤患者，與以往病例比較，植入率上升，GVHD發(fā)生率減低【16隨訪資料表明，MSC與HSC共移植是安全的，無急性和遠(yuǎn)期的MSC相關(guān)毒性【17】這些初步結(jié)果給MSCI瞄床應(yīng)用帶來了希望肝細(xì)胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)，又稱擴(kuò)散因子factor，SF)，是由分子量69KD的重鏈(d鏈，465個(gè)氨基酸)和分子量34KD輕鏈(B鏈，234個(gè)氨基酸)通過二硫鍵連接成的異二聚體糖蛋白質(zhì)。HGF種多功能的細(xì)胞因子，它能夠刺激多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化，參與血管再HGF在肝臟再生、血管生成、組織修復(fù)及腫瘤生長等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用外，已有的實(shí)驗(yàn)證明，肝細(xì)胞生長因子具有免疫調(diào)節(jié)作用。多種免疫細(xì)胞包括腺T淋巴細(xì)胞、活化的B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等均表達(dá)HGF受體C—met，并且分泌HGF。KuroiwaT和ImadoT先后分別報(bào)道了人源HGF基因在小鼠異基因移植模型中的免疫抑制和修復(fù)損傷作用：HGF可抑制GⅧD靶器官中細(xì)胞凋淋巴細(xì)胞浸潤，減輕組織損傷，抑制炎性因子表達(dá)，有助于建立宿主抗原免受，從而減輕aGVHD和cGVHD的發(fā)生；同時(shí)由于HGF對胸腺有保護(hù)作用進(jìn)骨髓T細(xì)胞再生及其對異基因抗原應(yīng)答能力，因而保留了GVL效應(yīng)，可見對預(yù)防移植后GⅦD很有意基于以上MSC和HGF在免疫調(diào)節(jié)方面的研究進(jìn)展，我們設(shè)想高表達(dá)HGFMSC應(yīng)具有更好的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)；為此，本研究分離擴(kuò)增了人和小鼠的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；并利用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法，使MSC高表達(dá)HGF；評價(jià)了基因轉(zhuǎn)移對MSC表型和分化性能以及對MSC存活、遷移等生物學(xué)行利用體內(nèi)外研究模型，確定了高表達(dá)HGF基因的MSC免疫調(diào)節(jié)作用，該研大MSC的應(yīng)用并提高其效率第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒第一部分：人和小鼠第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，從發(fā)育級系上看，干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞、胚胎千細(xì)胞和成體干細(xì)胞等。骨髓中存在造血干細(xì)cells，HSCs)、間充質(zhì)于細(xì)胞cells，MSCs)造血血管母細(xì)胞(Hemangi【oblasts)及內(nèi)皮祖cells，EPC)等多種干／祖細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有向多種中胚層組織細(xì)胞分化能力，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)等。MSC作為基因治療的靶向載體既可以發(fā)揮治療基因的作用，又可以利用的組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)功能，因此，在造血干細(xì)胞移植、器官移植、各種組織床工作者的重視。此外，MSC在細(xì)胞和基因治療中有其獨(dú)特的優(yōu)勢從人骨髓中獲得，來源相對方便，分離培養(yǎng)方法已相對成熟；2)體外易于擴(kuò)增短期內(nèi)可達(dá)到治療所需數(shù)量；3)MSC是貼壁生長細(xì)胞，易于外源基因的導(dǎo)入表達(dá)，例如IL-3和GFP基因?qū)θ薓SC轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80~90％【181；4)具有分化潛能，并且可以植入不同組織，局部損傷和應(yīng)激更加刺激植入；5相關(guān)研究，我們首先進(jìn)行了人骨髓來源MSC及小鼠骨來源MSC的分離培并對其表型和功能進(jìn)行了鑒定11．1人骨髓樣來源于空軍總醫(yī)院的健康獻(xiàn)髓者，加肝素(100U／m1)抗凝C57BL／6J小鼠，雌性，2．3周齡，二級，由本院動物中心提供1．3主要試a—MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公第一部分：人和小鼠間充質(zhì)千細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒Cell公篩選第一部分：人和小鼠間充質(zhì)千細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒Cell公篩選后胎牛血清購自美國胰蛋白酶購自美國Amresco公HEPES購自瑞典AmershamL一谷氨酰胺購自北京紅星生化技術(shù)公Percoll原液購自瑞典Pharmacia公司II型膠原酶購自美國Sigma公鼠抗人單克隆抗體：CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CDl05、CDl66HLA-ABC和HLA—DR購自美國Becton—DickinsonSca一1購自美國Becton—DickinsonB．甘油磷酸鈉鹽和維生素C鈉鹽購自Fluka公TGF一131購自美國PeproTech公磷酸對硝基苯酚二鈉鹽購自美國Amresco公BCIP／NBT堿磷酶染色試劑盒購自北京中杉金橋生物公鈣沉積檢測試劑盒購自北京中生北控生物公Trizol試劑購自美國Invetrogen公RT-PCR所需試劑：M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司；RnasinDNA聚合酶和dNTPs購Oligo(dT)15購自日本TaKaRa公司ToYoBo公司。DL2000marker購自北京天為時(shí)代生物公RT-PCR引物序YU．-人ALP、OCN、CollagentypeII、PPARr2和B—小鼠OCN、CollagentypeII、PPAR72和HPRT由Invetrogen英駿生物公司瓊脂糖粉購自美國Boiwest公肝素、青鏈霉素、油紅。染料及其他分析純化學(xué)試劑均為國產(chǎn)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．4位置確定互補(bǔ)序列，一般為15—20堿基；G+C含量最好在45．55％左右11m=4(G+c)+2(A+T)估算Tm值，確定退火第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．4位置確定互補(bǔ)序列，一般為15—20堿基；G+C含量最好在45．55％左右11m=4(G+c)+2(A+T)估算Tm值，確定退火溫度的大致范圍，盡量使兩引物的值相近；引物3’端不應(yīng)該選A，因其容易引發(fā)錯(cuò)配；軟件分析證明引物與非互區(qū)同源性低，引物內(nèi)部及引物之間(尤其3’端)避免二級結(jié)構(gòu)的形成。以下為和小鼠PCR引物序列Sense5’CTTCAAACCGAGATACAAGCACTCAnti5’CAGGCCCATTGCCATACASense5’GCGGTGCAGAGTAnti5’CCTCCTGAAAGCCGATGT CollagenSense5’AGGAGCAGAGCAAAGAGGSense5’GGGACC1AGCTAACTACCp—Anti5’CAGTGATCTc盯Forward5’一Reverse5’一GGAGCTGCTGTGACArCC-Forward5'-GCCTCGCGGTGAGCCTGATC一CollagentypeReverse5’一CTCCATCTCTGCACGGGGT一Forward5'-GCTGTIHrGGGTGAAACTCTG一Reverse5’．A：IAAGGTGGAGATGCAGGTTC一 5’一CACAGGACTAGAACACCTGC一第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．5主要儀C02氣體培美國Thermoelectron公潔凈工第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．5主要儀C02氣體培美國Thermoelectron公潔凈工作北京半導(dǎo)體設(shè)備一4。C中國海爾公一80℃超低溫冰日本SanYo光學(xué)倒置顯微日本Olympus公高速臺式離心美國Heraeus公水平臺式細(xì)胞離心法國Jouan公臺式高速冷凍離心北京四環(huán)科學(xué)儀器磁力恒溫?cái)嚢枭虾２苄袩o線電元件FACSCalibur流式細(xì)美國Becton．Dickinson2．9流式數(shù)據(jù)分析軟WinRAR公R450型酶美國Bio—Rad公DU640型紫外分光光度MastercyclerPCR美國Eppendorf瓊脂糖凝膠水平電泳北京六一儀器紫外凝膠成像美國uvP公數(shù)碼照像日本Olympus公上海精科儀器細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)美國Costar公1．6主要試劑及配第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．6．1Percoll將Percoll原液用1．5MNaCI溶液稀釋10倍，作為第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1．6．1Percoll將Percoll原液用1．5MNaCI溶液稀釋10倍，作為貯液。將Percoll貯液和×PBS按0．56：O．44II型膠原酶消化液取II型膠原酶0．Ig，完全溶解于d—MEM培養(yǎng)基中，過濾除菌，加lOml(20％)胎牛血清，充分混勻即可1．6．3細(xì)胞培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)基(100U／m1)+鏈霉素(100ug／m1)，4℃放置1．6．4成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Osteogenic9】(1)1)1000xDex(Dexamethasone；地塞米松C22．H29F05，MW：392．46購自取25mg溶于去離子水成64ml，即得10。3M溶液，過濾除菌，EP管分裝一20℃凍存，使用時(shí)稀釋10倍即可2)IOOXp—GP(D—Glycerophosphatedisodium；B一甘油磷酸鈉鹽C3H706PNa25H20，Mw：306．12購自取3．069溶于a—MEM成10ml，過濾除菌，EP管分裝，一20。C凍存Salt；維生素C鈉鹽3)1000XAsAP(2-phospho—L-C6H806，MW：176．1購自取0．1619溶于去離子水成10ml，過濾除菌，EP管分裝，．20。C凍存(2)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑(工作液Dex：lOOnmol／L；B—GP：10retool／L：AsAP：0．05mmol／L(3)配制標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)培養(yǎng)液100ml：在88．7mla—MEM培養(yǎng)基中添加10ml胎血清(10％)，加入1000xDex0．1ml，100x[3一GPIml，1000xAsAP第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1000x青鏈霉素0．1ml，混勻，4℃保存1．6．5ALP顯色BufferlII緩沖液"Iris—HCl(PH=9．5)：100mM；NaCh100mM；MgCl2：50mM。取Tfis—NaCl0．58449，MgCl2第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒1000x青鏈霉素0．1ml，混勻，4℃保存1．6．5ALP顯色BufferlII緩沖液"Iris—HCl(PH=9．5)：100mM；NaCh100mM；MgCl2：50mM。取Tfis—NaCl0．58449，MgCl21．01659，用蒸餾水稀釋至100ml1)Tyrode’S平衡鹽溶液(Tyrode’SbManced成MgCh．6I-1NaI-D一葡萄糖充分混勻，過濾除菌，4。C2)溶液I：10mlVl磷酸對硝基苯酚二鈉鹽口-ni仃ophenylphosphate，c出斜購自Alllresco，使用終濃度5mM，配制濃度10配制100ml水溶液：需固體O．3719，溶于100ml蒸餾水，棕色瓶4。C保存3)溶液II：125mM甘氨酸水溶液甘氨酸3．1ml調(diào)節(jié)pH至10．5，補(bǔ)水至100ml，4。C保存氯化鎂使用終濃度lmM，配制濃度10第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒配制50ml水溶液：需固體0．1029，溶于50ml蒸餾水中，4"C保存第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒配制50ml水溶液：需固體0．1029，溶于50ml蒸餾水中，4"C保存堿性磷酸酶檢測試劑工作液：按照溶液I：II：III=10：8：25)ALP檢測終止液(3NNaOH)：6．OgNaOH溶于水成50ml1．6．7脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Adipogeniesupplements)‘1(1)1)100xDex(Dexamethasone；地塞米松)(10qM)：(同1．6．4中2)100XIBMX(3一isobutyl-1-methylxanthine；異丁基甲基黃嘌呤取100mg溶于DMSO成9ml，EP管分裝，．20。CC19H16C1N04，MW：357．79，購自取200mg溶于DMSO成5．5891ml，EP管分裝，一20。C凍(2Dex：lumol／L；IBMX：0．5retool／L；Indomethacin：100umol／L(3)配制標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)培養(yǎng)液100ml：在87．7mla—MEM培養(yǎng)基中添加10ml胎lml，500xIBMX0．2ml，100xIndomethacin血清(10％)，加入青鏈霉素O．1ml，混勻，4"COilRedO染O粉末溶于99％異丙醇100ml中，濾紙過濾，即得取0．59貯液；貯液與蒸餾水按照3：2比例在使用前混合即得工作液1．6．9三系非特異分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液100ml：在ft．一MEM培養(yǎng)基中添加10ml胎牛血(10％)，加入10ul，1000x青鏈霉素0．1ml，混勻，4"C保存DEPC處理在1L蒸餾水中加入 DEPC原液，充分混勻，置于37"C浸泡處理之后高壓蒸氣滅菌15rain質(zhì)量數(shù)分子量=1微摩爾數(shù)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒需要配制成50nmol／ml(50uM即0．25ug／u1)終濃度溶液，需加入PCR引用雙蒸水配制第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒需要配制成50nmol／ml(50uM即0．25ug／u1)終濃度溶液，需加入PCR引用雙蒸水配制成25uM終濃度溶液，EP管分裝，一20。C保存XTAE57．1ml，0．5M100ml，調(diào)pH值至7．0，補(bǔ)加蒸水至1升取瓊脂糖粉1．29，充分溶于1×TAE電泳緩沖液，加入7．5ulEB混即可2．1人間充質(zhì)干細(xì)胞分離培取肝素抗凝的正常人骨髓5ml，用lml注射器過濾后，加入PBS以1：1比稀釋骨髓，充分混勻，計(jì)數(shù)后調(diào)整有核細(xì)胞濃度為1x107cells／ml，按照1：1比將骨髓細(xì)胞懸液小心加于Percoll(1．0739／m1)工作液液面離心30min：吸出單個(gè)核細(xì)胞層，用兩倍體積的PBS稀釋，混勻，2000rpm離8min；用PBS再洗細(xì)胞1次；用完全培養(yǎng)基(ct-MEM+10％篩選FBS)重胞計(jì)數(shù)后按2×105cells／cm2密度分瓶培養(yǎng)；72h后換液，去除未貼壁細(xì)胞。以每3-4天換液。原代培養(yǎng)第4天可見分裂中的形態(tài)為紡錘形的貼壁細(xì)胞，第6可見明顯細(xì)胞克隆形成，第10天可見細(xì)胞呈多向螺旋生長達(dá)80％匯合，將細(xì)用0．05％胰蛋白酶EDTA消化傳代，按3000—6000cdls／cm2瓶，記為第1代(P1)，第3代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研2．2小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離培C57BL／6小鼠(雌性，2．3周齡)斷頸致死，75％酒精浸泡5min消毒；剪腿部皮膚肌肉，分別取出股骨和脛骨，剪去殘留骨骺端和肌肉，浸泡于完全基中；用注射器沖出骨髓后徹底沖洗骨髓腔；將骨段剪成大約lmm3大小的放入含有O．2％(1mg／m1)II型膠原酶的n．MEM+10％FBS完全培養(yǎng)基中，37。C200rpm振搖消化2h；終止消化后，用a—MEM沖洗骨片3遍，加入完全培養(yǎng)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒(it．MEM+10％篩選FBS+雙抗)，置于37"C，5％C02培養(yǎng)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒(it．MEM+10％篩選FBS+雙抗)，置于37"C，5％C02培養(yǎng)箱中；第3骨片周圍形成明顯的細(xì)胞克隆，此時(shí)更換培養(yǎng)基，以去除未貼壁細(xì)胞和骨5天可見克隆生長達(dá)80％左右匯合，將細(xì)胞用O．05％胰蛋白酶．0．53raMEDTA化傳代，按1500cdl“cm2接種新培養(yǎng)瓶，記為第1代(P1)，第3代細(xì)胞用實(shí)驗(yàn)研究第3代處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞用O．05％胰蛋白酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，每反應(yīng)取細(xì)胞1×106，加入冰冷的PBS后1200rpm離心8rain，重懸細(xì)胞于中，在人源細(xì)胞中加入飽和濃度的FITC或PE標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD31、CD34胞中加入飽和濃度的F1TC或PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD29、CD31、CD34、CD44BSA(或FBS)徹底洗滌細(xì)胞2遍，用FCMbuffer(含1％多聚甲醛+O．1％疊氮化Calibur流式+O．5％BSA的PBS液)固定細(xì)胞。應(yīng)用Becton．Dickinson公司胞儀以及WinMDI2．9軟件對抗體標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行檢測和分析2．4將對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1．5×104cells／：fL)，繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中加入標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑(Dex10raM+AsAP應(yīng)用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色試劑盒檢測鈣沉積培養(yǎng)細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)第14天，進(jìn)行堿磷酶染色。BCIP／NBT染色試劑操作步驟：BCIP(100x)、NBT(100x)顯色液與Bu船rIII按照1：100比例制工作液并充分混勻，用PBS沖洗細(xì)胞后將工作液滴加在細(xì)胞上，0．5一lh觀察結(jié)果第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒培養(yǎng)細(xì)胞成骨第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒培養(yǎng)細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)第14天，進(jìn)行ALP定量。用BBS洗滌細(xì)空白孔作對照)；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中預(yù)加NaOH終止液25“l(fā)／孔，從24板移取100Ill／孔至96孔板相應(yīng)孔中，405ilnl酶聯(lián)儀測定光密度值，即OD4052．4．3鈣沉積定培養(yǎng)細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)第21天，進(jìn)行鈣沉積定量。用PBS洗滌細(xì)胞2遍加入O．5NHCL0．4ml／孑L，振搖4．6h；將Kit中R1、R2液按1：1混合配制工液；在96孔板中預(yù)先加入工作液200111，孔；從振搖后的24孔板移取4uF孑L至孔板相應(yīng)孔中，室溫放置5min，570nm酶聯(lián)儀測定光密度值，即OD5702．5脂肪分化誘導(dǎo)及檢將對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1．5x104cells／j：L)導(dǎo)組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中加入標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑(Dexo．5mM+消炎痛100uM)進(jìn)行脂肪分化誘掣1吼，每3天換液，第8天進(jìn)O染色色1—2h，70％酒精洗去過多染料，再用蒸餾水清洗，鏡下觀察2．6軟骨分化誘導(dǎo)及檢應(yīng)用微滴培養(yǎng)方法進(jìn)行軟骨分化誘導(dǎo)[2012”。簡言之，將濃縮的細(xì)胞懸液(8×106cells／m1)滴至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中心處，置于6C貼壁2h，將軟骨分誘導(dǎo)液(0【一MEM+1％FBS+6．25u∥ml胰島素+50nM維生素C磷酸鹽TGF—B1+1％抗生素)輕輕覆蓋于細(xì)胞團(tuán)上，誘導(dǎo)維持2周2．6．1文獻(xiàn)表明在PH值曼1時(shí)，一種特殊染色可以檢測存在于軟骨基質(zhì)中的硫酸第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒蛋白聚糖【”。軟骨分化第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒蛋白聚糖【”。軟骨分化誘導(dǎo)2周時(shí)，用4％多聚甲醛室溫固定細(xì)胞團(tuán)洗滌數(shù)次，在含1％(w／v)阿辛藍(lán)的0．1MHCL(PH1．0)溶液中染色30min，O．1MHCL清洗以去除多余染料2．7非特異分化誘導(dǎo)及檢將對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞接種于25cm2中培養(yǎng)瓶(1000cells／cm2)，非誘組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中加入Dex進(jìn)行三系非特異分誘導(dǎo)淵，每3天換液，第14天提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR，分別用13-(人)和HPRT(小鼠)作為mRNA定量的參照2．7．1半定量RT-PCR檢測三系分化基因表首先提取細(xì)胞總RNA：用PBS溶液洗細(xì)胞兩次，按lml／5x106cells比例培養(yǎng)瓶中加入Trizol試劑，反復(fù)吹打以充分裂解細(xì)胞；將細(xì)胞裂解液移入Triz01)，劇烈管中120009離心lOmin；取上清加入0．2ml氯仿(每蕩15s，室溫放置2min；4℃120009離心15min，使水相和有機(jī)相分取上層水相，移至另一新EP管中，加入O．5ml異丙醇(每 Tfiz01)，混勻室溫放置120009離心10mira棄上清，用75％的乙醇在空氣中自然干燥5～lOmin；用含RNA酶抑制劑的DEPC水溶解RNA，可55。C．60"C溫育10min。利用紫外分光光度計(jì)測RNA的純度，計(jì)算濃度，樣品于一70逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)過程為：RNA樣品2ug，OligodT引物lug，DEPC處理水補(bǔ)足14ul，混勻后70。C水浴5min，立即放于冰上，離心后加入下試劑：M-5ul，M-MLVRTlul，2．5mMdNTPs5ul，Rnasin(25U)；40"C水浴中反應(yīng)1h分別取eDNA樣品lul和0．1ul作為模板，用下述PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增參照因13-actin和HPRT第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒O．5BlendO-Blend模板模板依據(jù)參照基因擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行樣品mRNA定量，之后在25ulPCR反第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒O．5BlendO-Blend模板模板依據(jù)參照基因擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行樣品mRNA定量，之后在25ulPCR反應(yīng)中，應(yīng)用前述引物序列，按照下述反應(yīng)條件擴(kuò)增目的eDNA，1．2％瓊脂糖泳和紫外凝膠成像分析結(jié)果PCR反應(yīng)參H1．1mall942min_÷(94℃40see-÷58．2。cycles_÷72℃1094。40sec-94℃2min_÷(94。C94"C2min-÷(94。C40sec_÷72℃29see)x32cycles-95"C2min_÷(94"CB—cycles-PCR反應(yīng)參Mouse940C2lnin_(94"C40sec-÷50℃40sec-÷72℃24sec)×32cycles_÷72℃1094℃2min_÷(94。94。C2rain-÷(94℃40see_÷55℃40see_÷72℃21see)×32cycles_÷72℃1094。C2rain_÷(94"C40sec-÷52℃40see_÷72℃15see)x22cycles_÷72℃10第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒2．8統(tǒng)計(jì)學(xué)分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用學(xué)生t檢驗(yàn)對成骨分化堿磷酶和鈣形成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。P值<O．05則差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3．結(jié)3．1人間充質(zhì)干細(xì)胞生長形人MSC不同生長階段形態(tài)如圖1．1所示。經(jīng)Percoll密度梯度分離出人骨單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)，72h后換液去除未貼壁細(xì)胞。原代培養(yǎng)第4天可見分裂中的纖維樣貼壁細(xì)胞(A)，第6天可見多個(gè)細(xì)胞克隆形成(B)，第10天可見細(xì)均～的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，呈多向螺旋生長，80％克隆匯合形成單細(xì)胞層(C)CAB圖1-1人MISC原代培養(yǎng)各生長時(shí)期A：+4d可見單個(gè)細(xì)胞分裂B：+6d細(xì)胞克隆形成C：+10d單細(xì)胞層形成3．2人MSC免疫表我們利用流式細(xì)胞儀檢測了本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況。其達(dá)細(xì)胞黏附分子：CD29、CD73(SH一3，4)、CDl66及HLAI類分子(HLA-第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒性間第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒性間充質(zhì)標(biāo)志的培養(yǎng)細(xì)胞比例高，因此這一結(jié)果從FCM對細(xì)胞表型檢測角度實(shí)了我們獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)(圖l一2畦kk．虻HLA-亡忙t虻圖l-2人MSC表型分收集第3代細(xì)胞，以相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采_【流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析3．3體外誘導(dǎo)人MSC脂肪分化潛能是問充質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一，我們采用MF報(bào)道的方案對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第8天光鏡下觀察可見與未誘導(dǎo)組相比細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞內(nèi)布滿圓形透亮脂質(zhì)空泡，應(yīng)用OilRed原位染色檢測脂質(zhì)沉積，染色后可見脂滴均呈紅色深染，說明有大量脂肪細(xì)胞成，因此這一結(jié)果從脂肪分化潛能角度證實(shí)了我們獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)性質(zhì)(圖l一3)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒BA圖1．3人MSC細(xì)胞進(jìn)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒BA圖1．3人MSC細(xì)胞進(jìn)行脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，第8天時(shí)可見胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，進(jìn)行Red染色，在顯微鏡下觀察可見大量A：未誘導(dǎo)細(xì)胞中沒有脂肪滴出現(xiàn)B：誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪滴形成3．4體外誘導(dǎo)人MSC成骨分化潛能也是問充質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一，我們采用MF報(bào)道的方案對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第14天光鏡下觀察可見與未誘導(dǎo)組相比細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，大量扁平狀細(xì)胞形成，成骨指標(biāo)檢測結(jié)果圖1-4A、4B所示，其中ALP活性定量MSC誘導(dǎo)組OD405為未誘導(dǎo)組為0．1742±0．0366，兩組問存在顯著性差異(p<O．01)；鈣沉積定量誘導(dǎo)組OD570為1．4594±0．068，未誘導(dǎo)組為O．306±0．028，著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0．01)，由此可知成骨指標(biāo)均為陽性表達(dá)，提示有大量成細(xì)胞生成，因此這一結(jié)果從成骨分化潛能角度證實(shí)了我們獲得的細(xì)胞符合間充干細(xì)胞性第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒露圖1-4人MSC成骨分細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，第14天時(shí)進(jìn)行ALP定量檢測(A)，第21天進(jìn)行沉積定量檢測(B)，+與未誘導(dǎo)相比，p<0．01，n=5，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義A：誘導(dǎo)第14天進(jìn)行ALP定量檢B：誘導(dǎo)第21天進(jìn)行鈣沉積定量檢第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒3．5體外誘導(dǎo)人MSC三系非特第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒3．5體外誘導(dǎo)人MSC三系非特異分問充質(zhì)干細(xì)胞在含有10。8M地塞米松的誘導(dǎo)液中培養(yǎng)2周，可誘導(dǎo)其向脂肪成骨和軟骨三系非特異分化。我們也對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外非特異誘導(dǎo)導(dǎo)第14天提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測分化相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)誘后參照基因Dactin的表達(dá)量相等時(shí)，誘導(dǎo)后細(xì)胞mRNA水平ALP、OCN、II的表達(dá)量明顯高于未誘導(dǎo)細(xì)胞(圖1—5)，而它們分別是成骨和脂肪和軟骨分化的分子標(biāo)志物。因此這一結(jié)果從非特異分化潛能角度證實(shí)了我獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)圖1-5特異性分化基因的表地塞米松誘導(dǎo)分化第14天，Trizol試劑裂解細(xì)胞后提取總RNA，應(yīng)用RT-II的表達(dá)。D-actin作為參照基因方法檢測ALP、OCN、PPARy2、3．6小鼠間有研究證實(shí)小鼠骨密質(zhì)中的問充質(zhì)干細(xì)胞含量比骨髓更豐富‘241，本實(shí)采用ZK[251等報(bào)道的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，將消化后骨片接第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)第3天可見骨片周圍出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆[1—6A]，第5天約80％細(xì)胞克隆匯合，形成單細(xì)胞層[圖1—6B]BA圖1-6小鼠MSC形A：小鼠股骨骨片培養(yǎng)+3d骨片周圍形成細(xì)胞克隆B：muMSC．P1單細(xì)胞層3．7小鼠MSC免疫表我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了從小鼠骨密質(zhì)中分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原，如l一7所示，95％以上的細(xì)胞表達(dá)Sca—l(干細(xì)胞抗原．1，(endoglin)表達(dá)陽性率約50％，同時(shí)其不表達(dá)CD34(小鼠造血系、內(nèi)皮系問充質(zhì)系祖細(xì)胞的非特異標(biāo)志)，CD45(血細(xì)胞標(biāo)志)和CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志這一結(jié)果從細(xì)胞表型角度證實(shí)了我們獲得的細(xì)胞群符合問充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒％一卜艇妊怪CDl5Ca-第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒％一卜艇妊怪CDl5Ca-圖1-7流式細(xì)胞儀檢測小鼠MSC表收集第3代細(xì)胞，以相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析我們采用PittengerMF報(bào)道的方案對分離培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行體外脂肪、成RedO染色，第10天和第14天分別進(jìn)行和軟骨分化誘導(dǎo)。于第8天進(jìn)行和blue染色。圖1-8A和8B顯示脂肪分化誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成脂肪滴，未導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)則無；圖l一8C和8D顯示成骨分化未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞ALP活性，誘后ALP顯著增多；另外，當(dāng)用Dex、TGF一口等誘導(dǎo)問充質(zhì)細(xì)胞向軟骨分化時(shí)可形成細(xì)胞外基質(zhì)富集硫酸化蛋白聚糖的細(xì)胞團(tuán)，在酸性環(huán)境下能夠應(yīng)用阿辛特異性檢測硫酸化蛋白聚糖，如圖1．8E和8F所示，在軟骨分化誘導(dǎo)液中培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)出阿辛藍(lán)染色陽性，表明在其胞外基質(zhì)中存在硫酸化蛋白聚糖，相對第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒未經(jīng)分第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒未經(jīng)分化誘導(dǎo)的細(xì)胞無明顯染色。因此，我們肯定此群細(xì)胞能夠特異性分化為肪、成骨和軟骨細(xì)胞，這一結(jié)果從多向分化潛能角度證實(shí)了我們獲得的細(xì)胞圖l-8小鼠MSC多向分A、B：細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)脂肪分化培養(yǎng)，第8天時(shí)可見胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴0色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴(B)，未誘導(dǎo)組中沒有脂肪滴形成(A)c、D：細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)，第10天進(jìn)行ALP活性染色，誘導(dǎo)后細(xì)胞顯ALP染色陽性(D)，未誘導(dǎo)組沒有被染色(cE、F：細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)軟骨分化培養(yǎng)，第14天進(jìn)行阿辛藍(lán)染色，誘導(dǎo)后細(xì)胞顯示藍(lán)染色陽性(F)，未誘導(dǎo)組陰性(E)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒根據(jù)文獻(xiàn)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們采用Dex作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的體外非特PPAR72和CollagenII。當(dāng)誘導(dǎo)前后參照基因HPRT的表達(dá)量相等時(shí)，誘導(dǎo)后胞三種系列特異性基因均呈陽性表達(dá)，未誘導(dǎo)細(xì)胞呈陰性表達(dá)或低水平表達(dá)(l一9)。因此這一結(jié)果從非特異分化潛能角度證實(shí)了我們獲得的細(xì)胞符合問充質(zhì)細(xì)胞性質(zhì)未誘導(dǎo)組誘導(dǎo)圖1-9系列特異性分化基因的表地塞米松誘導(dǎo)分化第14天，Trizol試劑裂解細(xì)胞后提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方檢測OCN、 II、PPARy2的表達(dá)。HPRT作為參照基因4、討1960s至1970s期間，F(xiàn)riedenstein等[26-29克隆的基質(zhì)細(xì)胞，研究表明這些細(xì)胞不僅可形成CFu—F，而且在特定的培養(yǎng)條第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒下體外可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒下體外可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，之后許多資料均證實(shí)能性和可塑性。1999年cells，MSC)的概念33】、胎盤【34】、羊水[35】、心臟‘361、骨骼肌【37】、脂肪組織【38滑液組織【391和胰腺【40】。從現(xiàn)有的研究結(jié)論看，我們可以推斷基本上所有包締組織的器官均存在MSC。各組織中MSC含量均低，例如骨髓中MSC}=L1／100000【4“。在移植免疫以及其它研究中最常用的細(xì)胞來源仍是骨髓MSC分離方法主要有：貼壁培養(yǎng)法、流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠法和基技術(shù)。應(yīng)用貼壁法分離人骨髓MSC已十分成熟也得到了肯定，但普通貼壁法卻法成功分離和培養(yǎng)出性質(zhì)均一的小鼠MSC群，主要因?yàn)樾∈蠊撬栀N壁細(xì)胞成分雜，含有的MSC數(shù)量較少而造血細(xì)胞較在分離人骨髓來源MSC時(shí)，我們把密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合。根據(jù)度差別，用比重為1．0739／ml的Percoll_=E作液進(jìn)行各細(xì)胞組分的分離，經(jīng)梯度離后能有效地除去絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板和脂肪細(xì)胞，獲得較高純度單個(gè)核細(xì)胞群，然后根據(jù)MSC與造血細(xì)胞貼壁性能差別，貼壁培養(yǎng)過程中隨換去除未貼壁的造血細(xì)胞。貼壁細(xì)胞主要是MSC，但也混有少量的單核或巨噬細(xì)以及成纖維細(xì)胞，利用這些細(xì)胞與MSC對塑料培養(yǎng)瓶的貼壁性強(qiáng)弱不同，細(xì)胞代時(shí)用0．05％胰蛋白酶靜置消化2—3分鐘后，MSC開始迅速從培養(yǎng)瓶壁單核巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞由于貼附性強(qiáng)仍未脫落，通過掌握胰蛋白酶的消化時(shí)間分選MSC，使其得到純化。經(jīng)2—3次傳代篩選后細(xì)胞形態(tài)均一，實(shí)明，我們所采用的分離方法能夠達(dá)到分離純化細(xì)胞的目的，并且不影響細(xì)胞生狀態(tài)，可長期培養(yǎng)擴(kuò)增為驗(yàn)證分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，我們對其表型及功能當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增至第3代以后，其表現(xiàn)出比較均一的細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)流式細(xì)儀檢測，此群細(xì)胞表面表達(dá)黏附分子：CD29、CDl66，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子CD73[4”、CDl05[43】；但不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31(PECAM一1)，血細(xì)胞標(biāo)CD34和CD45；表達(dá)HLA—ABC(HLAI要提呈內(nèi)源性抗原)而不表達(dá)HLA—II類分子，主要表達(dá)在抗原提呈第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒胞以及活化T細(xì)胞表面，參第一部分：人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒胞以及活化T細(xì)胞表面，參與外來抗原提呈過程)。因此，我們培養(yǎng)的細(xì)胞不無造血細(xì)胞混雜，而且符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征由于hMSC形態(tài)學(xué)與成纖維細(xì)胞相似，所以必須通過體外誘導(dǎo)分化的方法明確其是否具有多向分化的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。我們對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)骨分化、成脂肪分化和三系非特異分化，各項(xiàng)分化相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果均證培養(yǎng)的細(xì)胞具有多向分化潛能，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能特征從小鼠骨髓中培養(yǎng)MSC的方法已有多例報(bào)道，但是這些研究旨在解決其中顯存在的造血細(xì)胞混雜的問題，主要途徑是免疫磁性分選除去血細(xì)胞[4”，在培液中添加成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF．2)維持muMSC的干細(xì)胞性質(zhì)[451，或者續(xù)傳代培養(yǎng)刺激muMSC擴(kuò)增【46】，然而這些操作效果有限。muMSC的另外一個(gè)源就是骨B等【24】曾經(jīng)于2002年報(bào)道過在鼠骨密質(zhì)中存在間充質(zhì)干細(xì)胞干細(xì)胞樣細(xì)胞，他們通過免疫手段去除Lin。造血干細(xì)胞，之后應(yīng)用流式細(xì)胞儀擇Sea-1+細(xì)胞的方法從酶消化骨片后的游離細(xì)胞中成功分離出muMSC。另外，文獻(xiàn)報(bào)道一種從骨分離hMSC的相對簡單的方法，即將酶消化后的進(jìn)行貼壁培養(yǎng)【4”，然而用這種方法分離存在于小鼠骨密質(zhì)中的MSC的結(jié)得到的細(xì)胞群是不均一的，仍然有CD45+細(xì)胞和成骨細(xì)胞混雜，其優(yōu)勢生長造muMSC生長受抑本實(shí)驗(yàn)采用了ZK等【”峙艮道的將Ⅱ型膠原酶消化后的小鼠骨片接種的方法分離培養(yǎng)muMSC。我們發(fā)現(xiàn)，這種方法分離出的貼壁細(xì)胞層形成為5天左右，早于hMSCt481；第3代后呈形態(tài)均一的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。流式分顯示細(xì)胞表面分子CD29、CD44(纖維粘連蛋白和透明酯酸鹽受體)、CDl05(種血管特異性的TGF．B共受體，是間充質(zhì)干細(xì)胞和長期造血重建細(xì)胞的標(biāo)志性子)和Sca-1(是間充質(zhì)系列或造血系列于／祖細(xì)胞的表面標(biāo)志)陽性，而造血胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志女11CD34、CD45和CD31陰性，與文獻(xiàn)報(bào)道的由鼠骨髓中得的MSC表型相符?；蚯贸芯恳呀?jīng)查明，CDl05對血管生成有重要作用【49】Sea-1N在間充質(zhì)系列和造血系列干／祖細(xì)胞的自我更新中起到關(guān)鍵作用陬5”。后，我們檢測了這群細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)條件下向成骨、軟骨和脂肪分化的誘導(dǎo)成骨分化后細(xì)胞ALP形成以及成骨特異性基因OCN表達(dá)：在誘導(dǎo)軟骨分化typeII基因微滴培養(yǎng)中可見小分子蛋白聚糖的分泌，并且成功擴(kuò)增誘導(dǎo)脂肪分化后胞內(nèi)生成的脂滴以及PEAR3,2基因的表達(dá)均說明大量脂肪細(xì)胞第一部分：人和小鼠問充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒成，從上述結(jié)果可見我們從消化后骨片培養(yǎng)中得到的細(xì)胞的確是muMSC骨來源的與骨髓來源的muMSC具有第一部分：人和小鼠問充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒成，從上述結(jié)果可見我們從消化后骨片培養(yǎng)中得到的細(xì)胞的確是muMSC骨來源的與骨髓來源的muMSC具有同樣的生物學(xué)特性，包括貼壁生長、成纖樣細(xì)胞形態(tài)、表面抗原的表達(dá)、體外誘導(dǎo)條件下的多向分化潛基因治療靶細(xì)胞的選擇往往傾向于干細(xì)胞，因其具有自我更新能力和多向化潛能，可將細(xì)胞治療與基因治療較好地結(jié)合應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是療中應(yīng)用非常廣泛的一類干細(xì)胞，其相對容易分離培養(yǎng)，可在體外迅速擴(kuò)備向成骨、軟骨、脂肪、心肌、神經(jīng)等多種組織細(xì)胞分化的潛能；動物研究已明MSC可以植入至不同組織中，并且局部損傷和應(yīng)激會增強(qiáng)植入；其免疫原性不引起機(jī)體免疫反應(yīng)；外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)等，因此間充質(zhì)干細(xì)胞成為多治療性分子在基因治療中的靶向載體【52】。MSC與治療基因聯(lián)合作用，既能發(fā)功能性基因的治療功能，又能促進(jìn)損傷組織的修復(fù)與再生。例如，目前已經(jīng)成將COLIAl基因?qū)隡SC治療成骨不全[53】；用攜帶顯性負(fù)性突變體I型膠的腺病毒載體感染MSC成功修復(fù)脆骨病【5鍆。HemeOxygenase一1基因轉(zhuǎn)染可促新的研究顯示向鼠惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)注射MSC明顯抑制腫瘤的生長；IL一2因修飾MSC明顯增強(qiáng)抗腫瘤效果，延長帶瘤動物的生存期【56】；IFN—B基因修MSC抑制肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的生長【57】，這些研究證明以MSC作為靶向載體的基因療給難治性腫瘤的治療帶來希望，而且MSC可能具有直接限制腫瘤生長的功能此外，攜帶治療基因的MSC已經(jīng)應(yīng)用在許多疾病模型中，如帕金森病【583以及總之，以上研究提示MSC在多種疾病治療中潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，越來多的資料證明，在具體實(shí)施過程中，必須考慮植入細(xì)胞體內(nèi)存活、細(xì)胞遷分化專一性等諸多問題。為此，在以下的研究中，我們探討了HGF基因修MSC多種生物學(xué)特性的影響第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源問充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源問充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源生物學(xué)特性的影肝細(xì)胞生因子(Hepatocyte factor,HGF)是一種可引起多種細(xì)胞生學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，目前普遍認(rèn)為，HGF在細(xì)胞增殖、運(yùn)動與遷移、血管生成造血、抗凋亡、抗纖維化、修復(fù)組織損傷和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等方面發(fā)揮重要的生學(xué)功能。MSC表達(dá)HGF的受體c．met，外源性HGF對MSC遷移有很強(qiáng)的趨作用。有研究提出組織損傷明顯增強(qiáng)MSC的植入能力，而在組織損傷時(shí)血中是驅(qū)動骨髓或組織中的MSC向損傷靶器官遷移和植入的因素之一。因此，在織再生過程中，HGF／c—met信號通路對MSC植入損傷的組織發(fā)揮重要作用。外，MSC分泌的HGF也是組織損傷修復(fù)時(shí)重要的作用因子之一HGF．MSC聯(lián)合應(yīng)用的可行性，在以下的研究中，我們應(yīng)用攜帶HGF基因的病毒感染MSC，并觀察了基因修飾是否會改變其固有的細(xì)胞特性以及對MSC11．1腺病毒基因表達(dá)載攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad—GFP)和攜帶人肝細(xì)胞生長因基因的腺病毒基因表達(dá)載體(Ad—HGF)由放射醫(yī)學(xué)研究所三室通過細(xì)胞內(nèi)質(zhì)腺病毒。重組后攜帶HGF基因的腺病毒質(zhì)粒線形結(jié)構(gòu)示意圖如下圖A所示，第二部分：HGF基因修飾第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源問充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的1．2一-MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公Cell公篩選后胎牛血清購自美國胰蛋白酶購自美國Amresco公HEPES購自瑞典Amersham公第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源問充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的L一谷氨酰胺購自北第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源問充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的L一谷氨酰胺購自北京紅星生化技術(shù)公RNA酶A購自美國Sigma公鼠抗人單克隆抗體：CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CDl05、CDl66HLA-ABC、HLA—DR購自美國Becton—Dickinson公細(xì)胞分化誘導(dǎo)和檢測試劑見第一部RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑見第一PCR引物序列及反應(yīng)參數(shù)見第一部其他試劑及分析純化學(xué)試劑均為國產(chǎn)1．3美國electron公C02氣體培潔凈工作北京半導(dǎo)體設(shè)備一一80℃超低溫冰日本Sanyo公光學(xué)倒置顯微日本Olympus公熒光倒置顯微鏡IX-Tu。。C臺式高速冷凍離北京四環(huán)科學(xué)儀器水平臺式細(xì)胞離心法國Jouan公美國Heraeus公Biofuge高速臺式離心R450型酶美國Bio—Rad公Calibur流式細(xì)美國Becton—Dickinson第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的2．9流式數(shù)據(jù)分析軟第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的2．9流式數(shù)據(jù)分析軟WinRARDU640MastercyclerPCR美國Eppendorf公瓊脂糖凝膠水平電泳北京六一儀器紫外凝膠成像美國UvP公Transwell細(xì)胞遷移美國Costar1．4主要試劑及配1．4．1胰蛋白酶．EDTA(1)O．25％胰蛋白酶配制：將D—Hanks液或Dulbeceo液(統(tǒng)稱BSS)5．6％NaHC03調(diào)PH值至7．2左右，取胰酶粉末19，放入燒杯中，用少許BSS成糊狀，再補(bǔ)足至100ml，攪拌均勻，置于室溫4h或冰箱內(nèi)過夜，并不時(shí)攪拌振蕩。用濾紙過濾，再用無菌玻璃濾器(G6)或蔡氏濾器(EKS2、EKS3除菌，分裝后．20℃凍存。此時(shí)為1％濃度貯液。臨用時(shí)將其用BSS按1：4稀(即1份胰酶貯液加3份BSS)，即得O．25％胰蛋白酶溶液，其偏酸性，使用再用5．6％NaHC03調(diào)PH值至7．2左右(2)EDTA：化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versene液(3)胰酶一EDTA消化液：用無鈣、鎂鹽溶液溶解胰酶和EDTA，使其終濃度別為0．25％和0．02％，小瓶分裝，一20用1MNaOH調(diào)PH值至7．0．8．0，粉末23．89充分溶解于100ml雙蒸水中除菌，EP管分裝，．20。C凍存。使用時(shí)在100ml完全培養(yǎng)基中加入lml貯液第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的即使第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的即使用終濃度為10mML-谷氨酰胺溶分子式：C5HIoN203，Mw；146．15。配制50x貯液(250mM)：取L．谷胺粉末3．6549充分溶解于100ral三蒸水中，過濾除菌，EP管分裝，一20。C凍存使用時(shí)，在100ml完全培養(yǎng)基中加入2ml貯液，即使用終濃度為5mM1．4．4配制1000x貯液：取青霉素(鈉鹽)100萬U，和鏈霉素(雙氫萬ug)溶于無菌三蒸水10ml中(每ml含青霉素10萬u和鏈霉素10萬EP管分裝，．20。C凍存。使用時(shí)，在100ml完全培養(yǎng)基中加入100ul貯液，即用終濃度為青霉素100U／ml和鏈霉素100ug／ml1．4．54％多聚甲醛固定拌并滴加2NNaOH至清澈透明，冷卻后補(bǔ)加0．1MPBS至100ml(pH7．4～7．6使用時(shí)稀釋至濃度分別為1％和2％1％結(jié)晶紫染色取19結(jié)晶紫染料，充分溶于100ml蒸餾水中，濾紙過濾1．4．8細(xì)胞分化誘導(dǎo)及檢測試劑見第一部2．2．1重組腺病毒構(gòu)建、擴(kuò)增純化以及病毒滴度測實(shí)驗(yàn)室制備重組腺病毒Ad—HGF的過程如下：首先構(gòu)建攜帶人肝細(xì)胞生長子基因的穿梭質(zhì)粒pXCJLl一CMV／pA—HGF，然后用LipofeaAMlN介導(dǎo)該質(zhì)第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的Ad—HGF，并以噬斑分析法篩選單克隆重組第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的Ad—HGF，并以噬斑分析法篩選單克隆重組腺病毒，PCR法鑒定陽性克隆之后行擴(kuò)將293細(xì)胞接種于150mm平皿，生長至90％匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行病毒感染，染強(qiáng)度(multiplicityofinfection，MOI)約為8-10個(gè)噬斑形成單位(plaqueunit，pfu)／細(xì)胞。感染36—48h細(xì)胞出現(xiàn)完全細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，收集細(xì)胞，凍存于．80℃。累計(jì)到50。60個(gè)平皿時(shí)統(tǒng)一純化病毒氯化銫密度梯度離心法純化病毒：將收集的293細(xì)胞于一80oc并反復(fù)凍融3次，2500rpm離心10min去除細(xì)胞碎片。依次將溶液、2．5ml1．359／mlCsCl溶液和2．5ml1．259／mlCsCl溶液加入12ml超速離心中，將凍融后的待純化病毒加于CsCl梯度溶液之上。10*C離心2h，1．359／mlCsCl溶液和CsClCsCl溶液混合10℃離心18h。吸取白色霧狀病毒帶，與1-2倍體積的PBS稀釋。以PBS為透析液于4。C透析病毒，每2h液，共換5次。取出純化的病毒，加無菌甘油至終濃度為10％，分裝，一80。C存紫外分光光度儀測定病毒顆粒數(shù)及純度：根據(jù)光密度(opticaldensity,OD10％十二烷基硫測定病毒的顆粒數(shù)：取2rtl純化的病毒加入97山PBS和l鈉sulfate,SDS)，混勻；以99山PBS加1出10％SDS作為空白照。測定OD260nm和OD280nm，據(jù)此估算病毒的顆粒數(shù)和純快速CPE分析、噬斑分析法測定病毒感染滴度(pfu／m1)：取10wl純毒加入99CI山DMEM培養(yǎng)基(102倍稀釋)，混勻后取100I_tl稀釋于培養(yǎng)基中(103倍稀釋)，以此類推進(jìn)行倍比稀釋，直至10”倍稀釋。提前一天293細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，接種量為2x106細(xì)胞／孔。24h后細(xì)胞長至90％匯時(shí)，將各孔中培養(yǎng)液吸出，分別加入102一1012倍稀釋的病毒液，培養(yǎng)1—2h。CPE分析：將102．106倍稀釋的病毒液從各孔中吸出，每孔加入2ml含的DMEM培養(yǎng)基。36．48h后觀察CPE，選出發(fā)生100％CPE下列公式l計(jì)算病毒的感染滴度。噬斑分析法：將107．1012孔中吸出，每孔加入3ml瓊脂糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4．7d至噬斑形成。選出噬數(shù)在30-100的稀釋倍數(shù)，根據(jù)下列公式2計(jì)算病毒的感染滴度。最后，采用第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的感細(xì)胞病變法第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的感細(xì)胞病變法檢測有復(fù)制能力的腺病毒。檢測分析結(jié)果顯示制備的病毒純度好滴度高，有復(fù)制能力的腺病毒存在(附)公式1：感染滴度(pfu／m1)=(2x106細(xì)胞／孑L)×稀釋倍數(shù)×10／公式2：感染滴度(pfu／m1)=平均噬斑數(shù)×稀釋倍2．2重組腺病毒感染人間充質(zhì)干細(xì)將處于對數(shù)生長期的第3代人MSC按照具體實(shí)驗(yàn)所需的合適密度接種于養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，生長24h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)論和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將感染強(qiáng)(MOI)設(shè)為150pfu／細(xì)胞，用重組腺病毒Ad-HGF和Ad。GFP感染人MSC程如下：吸棄培養(yǎng)上清，加入含Ad—GFP或Ad．HGF病毒顆粒的無血清n—培養(yǎng)基孵育2h，然后換成含10％血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并每天用熒光實(shí)驗(yàn)室前期研究認(rèn)為腺病毒感染后48h時(shí)目的基因的表達(dá)水平最高此結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)用腺病毒Ad．GFP感染人MSC后，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)和GFP光強(qiáng)度，在感染48h時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GFP熒光蛋白表達(dá)率／感染效率，程如下：消化細(xì)胞后用PBS洗細(xì)胞兩遍，重懸于含1％多聚甲醛的PBS液進(jìn)行檢測ELISA法檢測感染后HGF基因表pftff細(xì)胞進(jìn)行感染，每48h收集培養(yǎng)上清(．70。C凍存)更換新如下：將lOOpl一系列濃度梯度稀釋的HGF標(biāo)準(zhǔn)品ng／ml，12．59．6)以將不同時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)上清與包被液(0．5mol／1NaHC03緩沖液1的比例混勻，每孔100ul加入酶標(biāo)板中，每個(gè)條件設(shè)2個(gè)復(fù)孔，4℃包被第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的棄包被液，用第二部分：HGF基因修飾對人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的棄包被液，用含5％小牛血清的PBS封閉過夜；加入HGF抗體，每孔100ul，37。孵育60rain；棄一抗，用含0．05％Tween一20的PBS洗去未結(jié)合的抗體加入二抗，每孔100ul，37。C孵育45min，用含0．05％Tween．20的PBS洗去未用腺病毒Ad—HGF以MOI=150pfu／細(xì)胞感染對數(shù)生長期第3代人MSC后時(shí)，將MSC和MSC—HGF細(xì)胞用0．05％胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)應(yīng)取細(xì)胞1×106，加入冰冷的PBS后1200rpm離心8min，重懸細(xì)胞于室溫避光放置30分鐘，用冰冷的PBS+I％BSA徹底洗滌細(xì)胞2遍，用(含1％多聚甲醛+O．1％疊氮化鈉+0．5％BSA的PBS液)固定細(xì)胞。應(yīng)Becton—Dickinson公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀以及WinMDI2．9軟件進(jìn)行檢和分MTT測定細(xì)將處于對數(shù)生長期的人MSC按1×103cdls／孑L比例接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)中，每個(gè)條件設(shè)17個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞生長24h后，用Ad-HGF或者Ad—GFPMOI=150pfu／細(xì)胞進(jìn)行感染，感染后48h時(shí)應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞OD570MTT24小時(shí)1次，連續(xù)3d，具體步驟是：每孔100p1培養(yǎng)基中加入液10ul，37。5％C02飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，每孔加入水平振蕩10min溶解紫色結(jié)晶，利用酶聯(lián)免疫吸附儀570nm波長測定各孔光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD570值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生