鏈球菌 鏈球菌

細(xì)菌主

講

人

：方勤鏈球菌屬（Streptococcus）鏈球菌屬是革蘭陽(yáng)性球菌，種類多，在自然界分布甚廣，有些能引起人及多種動(dòng)物發(fā)病，導(dǎo)致化膿、肺炎、乳腺炎、敗血癥等病癥。與獸醫(yī)學(xué)有關(guān)的鏈球菌有無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）、釀膿鏈球菌（S.pyogenes）、肺炎鏈球菌（S.pneμmoniae）、馬鏈球菌獸疫亞種（S.equissp.zooepidimicus）、豬鏈球菌（S.suis）等。其中，豬鏈球菌2型可引起豬腦膜炎、敗血癥、膿腫等；本菌也可感染人，引起腦膜炎、感染性休克，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致人死亡。豬鏈球菌（S.suis）1.形態(tài)染色革蘭陽(yáng)性，圓形或橢圓形，單個(gè)或雙個(gè)，少數(shù)呈短鏈狀排列。陳舊培養(yǎng)物可能呈革蘭陰性，在液體培養(yǎng)基中以鏈狀為主，能形成莢膜，無(wú)芽孢。2.培養(yǎng)特性多數(shù)兼性厭氧，最適pH為7.4～7.6，最適培養(yǎng)溫度為36℃。營(yíng)養(yǎng)要求豐富，接種在哥倫比亞（TSA、腦心浸液瓊脂）血平板上36℃培養(yǎng)24h，形成細(xì)小、圓形微凸、表面光滑而濕潤(rùn)的灰白色菌落，菌落直徑1～2μm。α或β溶血，有的為α溶血，但延時(shí)培養(yǎng)后則變?yōu)棣氯苎?。豬鏈球菌2型在綿羊血平板上呈α溶血，而在馬血平板上則為β溶血。在BHI、TSB、馬丁肉湯（添加動(dòng)物血清）等液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，肉湯混濁。3.生化反應(yīng)觸酶陰性，七葉苷、精氨酸雙水解酶、淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，不分解甘露醇，V-P、馬尿酸鈉試驗(yàn)陰性，10℃、45℃、6.5%NaCl、pH9.6肉湯中均不生長(zhǎng)。4.分離鑒定（1）豬鏈球菌分離鑒定流程：扁桃體、鼻腔拭子可接種到選擇性THB增菌液試管中，36℃培養(yǎng)24～48h后再劃線接種到血平板上。豬鏈球菌在血平板上形成α或β溶血、圓形的小菌落，革蘭陽(yáng)性，短鏈；觸酶試驗(yàn)陰性，不分解甘露醇，純培養(yǎng)細(xì)菌可以進(jìn)一步用商品化細(xì)菌鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。（2）豬鏈球菌與其他細(xì)菌鑒別：主要有以下幾種。①豬鏈球菌與腸球菌鑒別：豬鏈球菌在45℃、6.5%NaCl、pH9.6肉湯中均不生長(zhǎng)，而腸球菌均生長(zhǎng)。②豬鏈球菌與葡萄球菌鑒別：豬鏈球菌觸酶試驗(yàn)陰性，6.5%NaCl培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)；葡萄球菌觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，6.5%NaCl培養(yǎng)基能生長(zhǎng)。③豬鏈球菌與馬鏈球菌獸疫亞種鑒別：按蘭氏分群，豬鏈球菌為R群，馬鏈球菌獸疫亞種為C群。按菌落形態(tài)分，豬鏈球菌為光滑、圓形的小菌落，短鏈；馬鏈球菌獸疫亞種為黏液的露滴狀菌落，長(zhǎng)鏈。按溶血性分，豬鏈球菌為α溶血或β溶血，β溶血不明顯；馬鏈球菌獸疫亞種在血平板上為明顯的β溶血。（3）豬鏈球菌血清型鑒定：豬鏈球菌根據(jù)莢膜抗原的不同分為33個(gè)血清型（1～31、33及1/2）及相當(dāng)數(shù)量無(wú)法定型的菌株（non-typeablestrains，NT），其中1、2、7、9型為豬的致病菌。血清凝集或協(xié)同凝集是當(dāng)前鑒定豬鏈球菌各血清型的經(jīng)典方法。將待檢菌落接種THB肉湯，于36℃培養(yǎng)18h±2h，取1.5ml培養(yǎng)物經(jīng)10000r/min離心3min，棄上清，加100μl生理鹽水將沉淀懸浮，取25μl菌體懸液分別與豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)血清和生理鹽水進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水對(duì)照不凝集、陽(yáng)性菌株凝集，試驗(yàn)成立。（4）PCR檢測(cè)①對(duì)病料分離的純培養(yǎng)物可進(jìn)行豬鏈球菌、豬鏈球菌1、2、7、9型、豬鏈球菌毒力因子和豬鏈球菌MLSTPCR（分子分型）檢測(cè)，可用煮沸法提取細(xì)菌DNA。②豬鏈球菌通用擴(kuò)增體系：premix12.5μl，ddH2O8.5μl，引物各0.5μl，模板2μl。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。③豬鏈球菌1、2、7、9型擴(kuò)增體系：premix12.5μl，ddH2O8.5μl，引物各1μl，模板2μl。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱5min；94℃30s，各自退火溫度30s，72℃1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。④豬鏈球菌7個(gè)毒力因子擴(kuò)增體系：可分為以下兩個(gè)擴(kuò)增體系。a.擴(kuò)增體系1（fbps、gdh、orf2和mrp）:premix12.5μl，引物fbps0.6μl、gdh0.7μl、orf21.2l、mrp0.2μl各1μl，模板3μl，用ddH2O調(diào)整終體積至25μl。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。b.擴(kuò)增體系2（sly、gapdh、epf）:premix12.5μl，引物sly、gapdh各0.7μl，epf0.2μl，DNA模板3μl，用ddH2O調(diào)整終體積至25μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)熱5min，94℃30s，52℃30s，72℃1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。⑤豬鏈球菌