食品微生物之檢驗(yàn)方法-仙人掌桿菌之檢驗(yàn)

食品微生物之檢驗(yàn)方法－仙人掌桿菌之檢驗(yàn)101年11月19日署授食字第1011902826號(hào)公告1. 適用範(fàn)圍：本方法適用於食品中仙人掌桿菌之檢驗(yàn)。2. 檢驗(yàn)方法：檢體經(jīng)系列稀釋後，以選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)及計(jì)數(shù)之方法或以三階三支進(jìn)行培養(yǎng)，配合MPN計(jì)數(shù)之方法。2.1. 工作環(huán)境：工作平臺(tái)須寬敞、潔淨(jìng)、光線良好，操作平臺(tái)光度為100呎燭光以上，密閉室內(nèi)換氣良好，儘可能沒(méi)有灰塵及流動(dòng)空氣。每15分鐘落菌數(shù)不超過(guò)15CFU／培養(yǎng)皿。2.2. 器具及材料2.2.1. 乾熱滅菌器。2.2.2. 高壓滅菌釜。2.2.3. 冰箱：能保持5±3℃。2.2.4. 培養(yǎng)箱：能維持內(nèi)部溫度溫差在±1℃以內(nèi)者。2.2.5. 水?。耗芫S持水溫溫差在±1℃以內(nèi)者。2.2.6. 攪拌均質(zhì)器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無(wú)菌操作者。2.2.7. 天平：可稱量到2000g者，靈敏度為0.1g；可稱量到120g者，靈敏度為1mg。2.2.8. 旋渦混合器（Vortexmixer）。2.2.9. 加熱器。2.2.10.顯微鏡：能放大至1000倍之一般光學(xué)顯微鏡。2.2.11. 光源：日光燈。2.2.12. 吸管：已滅菌。1mL吸管應(yīng)有0.01mL之刻度；5mL及10mL吸管應(yīng)有0.1mL之刻度。2.2.13. 培養(yǎng)皿：已滅菌，內(nèi)徑約90mm，深度約15mm，底皿之內(nèi)外面應(yīng)平坦，無(wú)氣泡、刮痕或其他缺點(diǎn)。2.2.14. 稀釋用容器：無(wú)菌袋或有1000mL、500mL、99mL或90mL標(biāo)記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。2.2.15. 試管：20×150mm，13×100mm試管或其它適用者。2.2.16. 無(wú)菌濾膜：孔徑0.45μm或以下之親水性醋酸纖維濾膜。2.2.17. 無(wú)菌棉花棒或塗抹棒。2.2.18. pH測(cè)定儀。2.2.19. 載玻片及蓋玻片：適用於染色及鏡檢者。2.2.20. 接種針及接種環(huán)（直徑約3mm）：鎳鉻合金，鉑銥或鉻線材質(zhì)，或可拋棄式者。2.2.21. 針筒、藥勺、剪刀、小刀及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。2.2.22. 吸管輔助器（Pipetteaid）。2.2.23. 塗抹曲棒：可滅菌或拋棄式者，直徑3～4mm，塗抹端長(zhǎng)45～55mm。2.2.24. 濾紙、研缽、杵。2.2.25. 褐色試藥瓶：可盛裝300mL以上者。2.2.26. 試藥：氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、硝酸鉀（KNO3，無(wú)亞硝酸鹽者）、結(jié)晶紫（crystalviolet）、草酸銨（ammoniumoxalate）、多粘桿菌素B硫酸鹽（polymyxinBsulfate）、碘化鉀、碘、沙黃O（safraninO）、30%過(guò)氧化氫溶液、冰醋酸（glacialaceticacid,1.049g/mL）、α-萘酚（α-naphthol）、氫氧化鉀、肌酸（creatine）、酪胺酸（tyrosine）、無(wú)水乙醇、95%乙醇、甲醇、鹽酸、液態(tài)石蠟油、礦物油、磺胺酸（sulfanilicacid）、鋅粉、孔雀綠（malachitegreen）、鹼性復(fù)紅（basicfuchsin）、TB石炭酸復(fù)紅ZN（TBcarbolfuchsinZN）、異丙醇（isopropanol）、石炭酸（phenol）、酚紅（phenolred）、葡萄糖（dextrose）及D-甘露糖醇（D-mannitol）均採(cǎi)用化學(xué)試藥級(jí)；溶菌酶（lysozyme）、蛋白腖（proteosepeptone）、胰化酪蛋白（trypticase）、蛋白腖（peptone）、去血纖維蛋白綿羊血（defibrinatedsheepblood）、酵母抽出物（yeastextract）、牛肉抽出物（beefextract）、洋菜（agar）、胰化酪蛋白腖（trypticasepeptone）、植物蛋白腖（phytonepeptone）及蛋白腖3號(hào)（proteosepeptoneNo.3）均採(cǎi)用微生物級(jí)。2.2.27. 試劑2.2.27.1. 革蘭氏染色液（Gramstainsolution）2.2.27.1.1. 哈克氏（Hucker's）結(jié)晶紫液（初染劑）： 溶液A：取結(jié)晶紫2g溶於95%乙醇20mL。 溶液B：取草酸銨0.8g溶於蒸餾水80mL。 將溶液A與溶液B混合，靜置24小時(shí)後以濾紙過(guò)濾，取濾液作為初染劑。2.2.27.1.2. 革蘭氏碘液（媒染劑）：取碘化鉀2g及碘1g置於研缽中，研磨5～10秒，加蒸餾水1mL研磨，次加蒸餾水5mL研磨，再加蒸餾水10mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於蒸餾水，將此溶液注入褐色試藥瓶，再以適量蒸餾水洗滌研缽及杵，以此洗液併入，加蒸餾水使成300mL。2.2.27.1.3. 哈克氏複染液（複染劑）：取沙黃O2.5g溶於95%乙醇100mL，供作複染原液。使用時(shí)，取原液10mL加入蒸餾水90mL，作為複染液 。註： 革蘭氏染色液因放久可能失效，因此購(gòu)買成品時(shí)，要注意其保存期限；自行配製者，應(yīng)檢查其染色效果。2.2.27.2. 芽孢染色液（Endosporestainsolutions）： 孔雀綠染色液：取孔雀綠10g溶於蒸餾水100mL，以濾紙過(guò)濾，去除未完全溶解之染劑。 沙黃O染色液：取沙黃O0.25g溶於蒸餾水100mL。2.2.27.3. 鹼性復(fù)紅染色液（Basicfuchsinstainingsolution）：取鹼性復(fù)紅0.5g溶於95%乙醇20mL，再以蒸餾水稀釋至100mL，染劑未完全溶解時(shí)，則以濾紙過(guò)濾。2.2.27.4. TB石炭酸復(fù)紅ZN染色液取鹼性復(fù)紅1.7g及石炭酸50g，溶於異丙醇95mL，再加蒸餾水905mL。2.2.27.5. 歐普氏試驗(yàn)試劑（Voges-Proskauertestreagents,VPreagents）： 溶液A：取α-萘酚5g溶於無(wú)水乙醇100mL。 溶液B：取氫氧化鉀40g溶於蒸餾水使成100mL。2.2.27.6. 亞硝酸鹽檢測(cè)試劑（Nitritedetectionreagents）： 溶液A：取磺胺酸1g溶於5N醋酸溶液125mL。 溶液B：取α-萘酚1g溶於5N醋酸溶液200mL。2.2.27.7. 3%過(guò)氧化氫溶液：取30%過(guò)氧化氫溶液1mL，加蒸餾水使成10mL，使用時(shí)新鮮配製。2.2.27.8. 液態(tài)石蠟油或礦物油：取液態(tài)石蠟油或礦物油20～50mL，裝入附蓋容器中約1/2滿，以121℃滅菌30分鐘。2.2.27.9. 5%酪胺酸溶液：取酪胺酸5g溶於蒸餾水100mL，混合均勻，以121℃滅菌15分鐘。2.2.27.10. 0.01N鹽酸溶液：取鹽酸8.5mL，溶於蒸餾水使成1000mL。取此溶液10mL，加水稀釋至100mL。2.2.27.11. 0.1%溶菌酶溶液：取溶菌酶0.1g溶於無(wú)菌0.01N鹽酸溶液65mL，加熱沸騰20分鐘，冷卻後以無(wú)菌0.01N鹽酸溶液定容至100mL。或取溶菌酶0.1g溶於蒸餾水100mL，混合均勻，以無(wú)菌濾膜過(guò)濾，冷藏備用。2.2.27.12. 5N醋酸溶液：取冰醋酸28.63mL，加水使成100mL。2.2.27.13. 1N氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉40.0g溶解於蒸餾水，加蒸餾水使成1L。2.2.27.14. 70%乙醇溶液：取95%乙醇736.8mL，以蒸餾水稀釋至1000mL。2.2.28. 稀釋液2.2.28.1. 生理食鹽水：取氯化鈉8.5g溶於蒸餾水1000mL，分裝於稀釋用容器中，經(jīng)121℃滅菌15分鐘。2.2.28.2. 磷酸鹽緩衝溶液（Butterfield'sphosphate-buffereddilutionwater）：取磷酸二氫鉀34g溶於蒸餾水500mL中，以1N氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值為7.2，再加蒸餾水使成1000mL，以121℃滅菌15分鐘，貯存於冰箱中，作為原液備用。使用時(shí)，取原液1.25mL加入蒸餾水至1000mL，分裝於稀釋用容器中，以121℃滅菌15分鐘。2.2.28.3. 分裝於稀釋用容器中，經(jīng)121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.0±0.1。2.2.28.4. 蛋白腖緩衝液（Bufferedpeptonewater）：取蛋白腖10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鈉3.5g及磷酸二氫鉀1.5g，溶於蒸餾水使成1000mL，分裝於稀釋用容器中，經(jīng)121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2±0.2。2.2.29. 培養(yǎng)基2.2.29.1. 甘露糖醇-蛋黃-多粘桿菌素培養(yǎng)基（Mannitol-eggyolk-polymyxinagar,MYP）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉抽出物（beefextract） 1g蛋白腖（peptone） 10gD-甘露糖醇（D-mannitol） 10g氯化鈉.... 10g酚紅（phenolred） 0.025g洋菜（agar） 15g蒸餾水... 900mL50%蛋黃液（50%Eggyolkemulsion）：

蛋洗淨(jìng)後，浸入70%乙醇溶液中1小時(shí)，以無(wú)菌操作方式破殼，續(xù)以無(wú)菌針筒或廣口吸管無(wú)菌操作，取出蛋黃，加入等量之無(wú)菌生理食鹽水，混勻後冷藏備用。

1萬(wàn)unit/mL多黏桿菌素B硫酸鹽溶液（PolymyxinBsulfatesolution）

取50萬(wàn)unit之多黏桿菌素B硫酸鹽1g，溶於蒸餾水50mL，以無(wú)菌濾膜過(guò)濾，冷藏備用。完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2±0.2。冷卻至約50℃，加入50%蛋黃液50mL及1萬(wàn)unit/mL多粘桿菌素B硫酸鹽溶液10mL，搖動(dòng)混合，使絮狀沈澱物分散均勻，搖動(dòng)時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，每一培養(yǎng)皿約倒入15?18mL，使用前培養(yǎng)基表面應(yīng)保持乾燥。2.2.29.2. 胰化酪蛋白-大豆-多粘桿菌素培養(yǎng)液（Trypticase-soy-polymyxinbroth,TSPB）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)液（Trypticasesoybroth,TSB）胰化酪蛋白腖（trypticasepeptone） 17g植物蛋白腖（phytonepeptone） 3g氯化鈉 5g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.5g葡萄糖（dextrose） 2.5g蒸餾水 1000mL1.5萬(wàn)unit/mL多黏桿菌素B硫酸鹽溶液：

取50萬(wàn)unit之多黏桿菌素B硫酸鹽1g，溶於蒸餾水33.3mL，以無(wú)菌濾膜過(guò)濾，冷藏備用。完全培養(yǎng)基：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基加熱溶解後，取15mL注入20×150mm試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3±0.2，冷卻後加入1.5萬(wàn)unit/mL多粘桿菌素B硫酸鹽溶液0.1mL。2.2.29.3. 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（Nutrientagar,NA）牛肉抽出物（beefextract）. 3g蛋白腖（peptone）.. 5g洋菜（agar）.. 15g蒸餾水. 1000mL

加熱溶解後，分裝於試管及三角瓶，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8±0.2。分裝於試管者，做成斜面培養(yǎng)基；三角瓶者，分裝於培養(yǎng)皿，每一培養(yǎng)皿倒入15-18mL，做成平板培養(yǎng)基，使用前培養(yǎng)基表面應(yīng)保持乾燥。2.2.29.4. 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液（Nutrientbroth,NB）牛肉抽出物（beefextract） 3g蛋白腖（peptone） 5g蒸餾水 1000mL加熱溶解後，分取2.5mL注入試管內(nèi)，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8±0.2。2.2.29.5. 酚紅葡萄糖培養(yǎng)液（Phenolredglucosebroth）蛋白腖3號(hào)（proteosepeptoneNo.3） 10g牛肉抽出物（beefextract） 1g葡萄糖（dextrose） 5g酚紅（phenolred） 0.018g氯化鈉 5g蒸餾水 1000mL加熱溶解後，分取2.5mL注入試管內(nèi)，以118℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.4±0.2。2.2.29.6. 硝酸鹽培養(yǎng)液（Nitratebroth）牛肉抽出物（beefextract） 3g蛋白腖（peptone） 5g硝酸鉀（KNO3，無(wú)亞硝酸鹽者） 1g蒸餾水 1000mL加熱溶解後，分取5mL注入試管內(nèi)，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.0±0.2。2.2.29.7. 酪胺酸培養(yǎng)基（Tyrosineagar）取2.2.30.3.節(jié)已滅菌營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基100mL，冷卻至48℃，加入5%酪胺酸溶液10mL，一面混合均勻，一面無(wú)菌分取3.5mL注入已滅菌之試管，並迅速冷卻做成斜面，以避免酪胺酸之析出。2.2.29.8. 溶菌酶培養(yǎng)液（Lysozymebroth）

取2.2.30.3.節(jié)已滅菌營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液99mL，冷卻後加入0.1%溶菌酶溶液1mL，混合均勻，再分取2.5mL至已滅菌之試管。2.2.29.9. 歐普氏培養(yǎng)液（Voges-Proskauermedium）蛋白腖（proteosepeptone）...... 7g氯化鈉 5g葡萄糖（dextrose） 5g蒸餾水 1000mL溶解後，分取2.5mL注入試管內(nèi)，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為6.5±0.2。2.2.29.10. 胰化酪蛋白-大豆-綿羊血培養(yǎng)基（Trypticasesoysheepbloodagar）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基（Trypticasesoyagar,TSA）胰化酪蛋白腖（trypticasepeptone） 15g植物蛋白腖（phytonepeptone） 5g氯化鈉 5g洋菜（agar） 15g蒸餾水 1000mL

加入去血纖維蛋白綿羊血50mL，搖動(dòng)混合均勻，每一培養(yǎng)皿倒入15-18mL。2.2.29.11. 運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培養(yǎng)基（Motilitymedium）胰化酪蛋白（trypticase） 10g酵母抽出物（yeastextract） 2.5g葡萄糖（dextrose） 5g磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 2.5g洋菜（agar） 3g蒸餾水 1000mL

加熱溶解後，分取2mL注入試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.4±0.2，使用前培養(yǎng)基表面應(yīng)保持乾燥。2.3. 檢液之調(diào)製2.3.1. 固態(tài)檢體：將檢體切碎混合均勻後，取50g，加入稀釋液450mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。2.3.2. 粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體：使用已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後，混合均勻，取50g，以下步驟同2.3.1.節(jié)之操作。2.3.3. 液態(tài)檢體：將檢體振搖均勻混合，取50mL，作為原液，以下步驟同2.3.1.節(jié)之操作。2.3.4. 冷凍檢體：須解凍者，如冷凍魚(yú)、禽畜肉、蔬果、水餃等，應(yīng)在冷藏之溫度下解凍（如2～5℃，18小時(shí)內(nèi)即可解凍完全）；亦可使用較高溫度快速解凍（置於45℃以下之水浴中，可在15分鐘內(nèi)解凍之檢體適用之）。解凍時(shí)應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)檢體，以加速解凍。俟檢體解凍後，再予以切碎並混合均勻。不須解凍者，如食用冰塊、冰棒等冰類製品，應(yīng)速先行使成適當(dāng)小塊；再依2.3.1.節(jié)，製成10倍稀釋檢液。如檢驗(yàn)工作無(wú)法立即進(jìn)行，應(yīng)將檢體貯存於-20℃。2.3.5. 凝態(tài)及濃稠液態(tài)檢體：如布丁、煉乳、海苔醬等，經(jīng)攪拌均勻後，取50g，以下步驟同2.3.1.節(jié)之操作。2.3.6. 系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液10mL，加至稀釋液90mL中，依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液，其稀釋方法如下圖所示。

2.3.7. 塗抺物（Swab）檢體：將塗抹棒之頭部置於已滅菌試管內(nèi)，以無(wú)菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，添加蛋白腖緩衝液5mL後，將試管蓋旋緊，於10秒內(nèi)來(lái)回叩擊手心使其劇烈振盪（振盪幅度需達(dá)15公分）50次，或以旋渦混合器充分振盪至塗抹物頭部之棉絮鬆開(kāi)，其溶出液可供作檢液。註：1. 除肉製品使用0.1%蛋白腖稀釋液外，其他檢體以磷酸鹽緩衝溶液作為稀釋液，其次為生理食鹽水。2. 3. 處理含油脂量多，不易勻散及易起泡沫之檢體時(shí)，應(yīng)加入適量已滅菌之乳化劑（如Tween80，使其於檢液中濃度為1%），並充分振搖，使之乳化。2.4. 鑑別試驗(yàn)2.4.1. 分離培養(yǎng)2.4.1.1. 平板計(jì)數(shù)法：將2.3.節(jié)之各系列稀釋檢液及（或）原液充分搖動(dòng)，混合均勻後，分別吸取0.1mL，置入MYP培養(yǎng)基，每一稀釋檢液至少做二重複，以塗抹曲棒均勻塗抹培養(yǎng)基表面乾後，倒置於30℃，培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察所形成菌落之生長(zhǎng)狀態(tài)，必要時(shí)，應(yīng)再行純化。仙人掌桿菌在MYP培養(yǎng)基的典型菌落為菌落中間部份通常為白色，邊緣為半透明、菌落周圍有濃厚沈澱之環(huán)帶（表示有卵磷脂酶之活性），背景有明顯之粉紅色者為可疑仙人掌桿菌。選取含15～150個(gè)可疑仙人掌桿菌菌落之MYP培養(yǎng)基予以計(jì)數(shù)，並由前述培養(yǎng)基各鉤取至少5個(gè)可疑菌落，分別接種於NA斜面培養(yǎng)基，置於30℃，培養(yǎng)24小時(shí)。2.4.1.2. 最確數(shù)（MostProbableNumber,MPN）法2.4.1.2.1. 當(dāng)檢體中仙人掌桿菌數(shù)低於100CFU/g或10CFU/mL時(shí)，採(cǎi)用此法。2.4.1.2.2. 分別吸取原液或2.3.6.節(jié)之10倍，100倍，1000倍等稀釋檢液1mL，接種於裝有TSPB培養(yǎng)液之試管中，各階試管相對(duì)的含檢體量1，0.1，0.01，0.001（g或mL），每一檢液各接種3支（三階三支），於30℃培養(yǎng)48±2小時(shí)，當(dāng)TSPB培養(yǎng)液呈混濁狀，取一接種環(huán)菌量，劃線於MYP培養(yǎng)基，於30℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，再依2.4.1.1.節(jié)鉤取至少5個(gè)可疑菌落，分別接種於NA斜面培養(yǎng)基，置於30℃，培養(yǎng)24小時(shí)。2.4.2. 鏡檢（Microscopicexamination）：自2.4.1.節(jié)之NA斜面培養(yǎng)基鉤取可疑菌落，作革蘭氏染色及芽孢染色後鏡檢，其結(jié)果符合仙人掌桿菌典型反應(yīng)者，則應(yīng)自NA斜面培養(yǎng)基取3mm接種環(huán)菌量，接種於裝有磷酸鹽緩衝溶液0.5mL之試管中，以旋渦混合器混合均勻後，進(jìn)行2.4.3.節(jié)生化試驗(yàn)。2.4.2.1. 革蘭氏染色（Gramstain）2.4.2.1.1. 加適量無(wú)菌生理食鹽水於載玻片上，以接種針（或環(huán)）自2.4.1.節(jié)之NA斜面培養(yǎng)基鉤取適量菌株，均勻塗抹成薄抹片，風(fēng)乾後迅速通過(guò)火焰3～4次微熱固定，勿直接火烤。2.4.2.1.2. 初染：將已固定之抹片，用哈克氏結(jié)晶紫液染1分鐘，水洗。2.4.2.1.3. 媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。2.4.2.1.4. 脫色：用95%乙醇洗至不再有紫色褪出時(shí)，再水洗，此步驟僅約30秒，惟視抹片之厚薄而定。2.4.2.1.5. 複染：用哈克氏複染液複染30秒，水洗。2.4.2.1.6. 風(fēng)乾。2.4.2.1.7. 鏡檢：呈現(xiàn)深紫色者為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈現(xiàn)淡紅色者為革蘭氏陰性菌。仙人掌桿菌為革蘭氏陽(yáng)性，菌體形成長(zhǎng)或短鏈狀，芽孢為橢圓形，位於中央或微偏離中央位置，芽孢具薄壁，且不使菌體膨脹者。2.4.2.2. 芽孢染色

依照2.4.2.1.節(jié)製成薄抹片，經(jīng)風(fēng)乾及固定後，以孔雀綠染色液染色，並以微火溫和加熱2～3分鐘，但應(yīng)避免染液蒸發(fā)，移走火焰，冷卻後以自來(lái)水沖洗，再加入沙黃O染色液染30秒後，以自來(lái)水沖洗，經(jīng)自然乾燥後於油鏡下觀察，呈現(xiàn)綠色者為芽孢，呈現(xiàn)紅色者為營(yíng)養(yǎng)菌體，仙人掌桿菌芽孢有明顯之綠色。2.4.3. 生化試驗(yàn)2.4.3.1. 觸酶試驗(yàn)（Catalasetest）：自2.4.1.節(jié)之NA斜面培養(yǎng)基鉤菌，塗抹於載玻片上，加3%過(guò)氧化氫溶液1～2滴，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生，產(chǎn)生氣泡者為正反應(yīng)，否則為負(fù)反應(yīng)。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.2. 厭氧下葡萄糖之利用（Anaerobicutilizationofglucose）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取2mm接種環(huán)菌量，接種於酚紅葡萄糖培養(yǎng)液中，徐徐加入已滅菌之礦物油或石蠟油至高度約2.5公分後，於35℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)液由紅色變成黃色者，為正反應(yīng)，否則為負(fù)反應(yīng)。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。硝酸鹽還原試驗(yàn)（Reductionofnitrate）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取3mm接種環(huán)菌量，接種於硝酸鹽培養(yǎng)液中，於35℃培養(yǎng)24小時(shí)後，各加入亞硝酸鹽檢測(cè)試劑溶液A及溶液B各0.25mL，輕輕搖勻後觀察結(jié)果，10分鐘內(nèi)呈橘紅色者為正反應(yīng)；顏色無(wú)變化時(shí)，加入少許鋅粉而有橘紅色呈現(xiàn)時(shí)，則為負(fù)反應(yīng)，否則亦為正反應(yīng)。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.3. 歐普氏試驗(yàn)（VPtest）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取3mm接種環(huán)菌量，接種於歐普氏培養(yǎng)基中，於35℃培養(yǎng)48±2小時(shí)後，取培養(yǎng)液1mL至另一已滅菌之試管中，加歐普氏試劑之溶液A0.6mL及歐普氏試劑之溶液B0.2mL後，再加入少許肌酸，輕輕搖勻，經(jīng)1小時(shí)後觀察結(jié)果，呈現(xiàn)粉紅色者則為正反應(yīng)，否則為負(fù)反應(yīng)。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.4. β-溶血性試驗(yàn)（β-Hemolysistest）：用油性簽字筆在胰化酪蛋白-大豆-綿羊血培養(yǎng)基之培養(yǎng)皿底劃分成6至8等分區(qū)域，每區(qū)可接種一株菌，各區(qū)標(biāo)示清楚後，自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取2mm接種環(huán)菌量，劃線於各區(qū)上，於35℃培養(yǎng)24小時(shí)。菌落生長(zhǎng)的周圍有明顯透明環(huán)者，則為正反應(yīng)；否則為負(fù)反應(yīng)。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.5. 酪胺酸分解試驗(yàn)自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取3mm接種環(huán)菌量，接種於酪胺酸斜面培養(yǎng)基上，於35℃培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)基斜面靠近菌落生長(zhǎng)的部分呈透明者，表示酪胺酸已被分解，為正反應(yīng)；否則為負(fù)反應(yīng)，應(yīng)再觀察5天。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.6. 溶菌酶耐性試驗(yàn)（Lysozyme-resistanttest）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取2mm接種環(huán)菌量，接種於溶菌酶培養(yǎng)液及NB培養(yǎng)液（後者為對(duì)照組），於35℃培養(yǎng)24小時(shí)。二者之培養(yǎng)液均呈混濁狀態(tài)者，則為正反應(yīng)；否則為負(fù)反應(yīng)，應(yīng)再置於35℃培養(yǎng)24小時(shí)後觀察。仙人掌桿菌為正反應(yīng)。2.4.3.7. 運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)（Motilitytest）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取3mm接種環(huán)菌量，穿刺接種於運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培養(yǎng)基中，深度約3mm，於30℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，沿穿刺線呈放射狀生長(zhǎng)者，為正反應(yīng)，否則為負(fù)反應(yīng)。大部分之仙人掌桿菌為正反應(yīng)，部分仙人掌桿菌為負(fù)反應(yīng)。2.4.3.8. 蛋白質(zhì)毒素晶體試驗(yàn)（Proteintoxincrystaltest）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取3mm接種環(huán)菌量，接種於NA斜面培養(yǎng)基，於30℃培養(yǎng)24小時(shí)後，再置於室溫2～3天，在載玻片上滴一滴無(wú)菌水，取菌體製成薄抹片，風(fēng)乾，通過(guò)火焰輕微加熱固定，冷卻後浸入甲醇中30秒，取出並傾掉載玻片上甲醇，自然風(fēng)乾。浸入TB石碳酸復(fù)紅ZN染色液或鹼性復(fù)紅染色液，並以微火溫和加熱染色液至蒸氣出現(xiàn)，移走火焰，俟1～2分鐘後，再重複此步驟一次，放置30秒，再以自來(lái)水沖洗，經(jīng)自然風(fēng)乾，於油鏡下觀察是否產(chǎn)生游離芽孢及暗黑色的四角形或鑽石狀之毒素晶體，毒素晶體經(jīng)常比游離芽孢稍小。仙人掌桿菌可產(chǎn)生游離芽孢，不產(chǎn)生毒素晶體。2.4.3.9. 根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)（Rhizoidgrowthtest）：自2.4.2.節(jié)磷酸鹽緩衝溶液取2mm接種環(huán)菌量，接種於NA平面培養(yǎng)基（應(yīng)盡量接種於培養(yǎng)基之正中央），俟表面乾燥後，於30℃培養(yǎng)24～72小時(shí)。菌落呈現(xiàn)毛髮狀或根