PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用

PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用1精選2021版課件PCR技術(shù)簡史

最早，Korana于1971年提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件—模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。

2精選2021版課件1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱的DNA聚合酶。此酶耐高溫，并提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR技術(shù)被廣泛的應(yīng)用。3精選2021版課件1.PCR技術(shù)的基本原理PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：即在高溫（93℃左右）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃）下，以dNTP為原料，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，從引物的5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。4精選2021版課件5精選2021版課件PCR反應(yīng)五要素：

即參加PCR反應(yīng)的五種主要物質(zhì)：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

6精選2021版課件酶濃度：催化PCR反應(yīng)約需酶量1ul(總反應(yīng)體系為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度：注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。如其中任何一種濃度不同于其它幾種時，就會引起錯配；濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。7精選2021版課件模板：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。8精選2021版課件Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。9精選2021版課件2.PCR技術(shù)的主要類型及其應(yīng)用

原位PCR技術(shù):

原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)移有重大的實(shí)用價值。其特異性和敏感性高于一般的PCR。10精選2021版課件反向PCR：

反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA，用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3’端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。利用反向PCR可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。

11精選2021版課件反向PCR原理示意圖

12精選2021版課件反向PCR的不足：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA；②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

13精選2021版課件錨定PCR：錨定PCR（AnchoredPCR,A-PCR）主要用于分析具有可變末端的DNA序列，Loh等用錨定PCR對人外周血淋巴細(xì)胞T細(xì)胞受體α-鏈的mRNA的多變性進(jìn)行了分析。先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴。Loh等在恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設(shè)一個引物，另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點(diǎn)，它可以并與PolyG尾巴結(jié)合，無論其余部分序列如何，只識別片段末端，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列，每一種都是獨(dú)特的，表明錨定PCR不對任何特殊序列有傾向性結(jié)果，可用于T細(xì)胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。

14精選2021版課件錨定PCR原理示意圖

15精選2021版課件標(biāo)記PCR和彩色PCR：

標(biāo)記PCR(LabelledPrimers，LP-PCR)，LP-PCR是利用同位素或熒光素對PCR引物的5‘端進(jìn)行標(biāo)記，用來檢測靶基因是否存在。彩色PCR(ColorComplementationassayPCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一種。它用不同顏色的熒光染料標(biāo)記引物的5’端，因而擴(kuò)增后的靶基因序列分別帶有引物5‘的染料，通過電泳或離心沉淀，肉眼就可根據(jù)不同熒光的顏色判定靶序列是否存在及其擴(kuò)增狀況，此法可用來檢測基因的突變，染色體重排或轉(zhuǎn)位，基因缺失及微生物的型別鑒定等。16精選2021版課件不對稱PCR：

不對稱PCR(asymmetricPCR)是用不等量的一對引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1。在PCR反應(yīng)的最初10～15個循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。不對稱PCR的關(guān)鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增，制備雙鏈DNA，然后以此雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備單鏈DNA。不對稱PCR制備的單鏈DNA，主要用于核酸序列測定。17精選2021版課件多重PCR：

一般PCR僅用一對引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。多重PCR(multiplexPCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。18精選2021版課件多重PCR的用途主要有兩方面：1.多種病原微生物的同時檢測或鑒定，它是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？捎糜谕瑫r檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染。2.病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定:某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個突變部位，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等。

19精選2021版課件多重PCR的特點(diǎn)有：①高效性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體；②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時偵檢；③經(jīng)濟(jì)簡便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。20精選2021版課件免疫-PCR：

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng)。它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。21精選2021版課件免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個：①抗原-抗體反應(yīng)，②與嵌合連接分子結(jié)合，③PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA)。該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備。在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結(jié)合位點(diǎn)，一個與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的