基因分析的基本策略

從上世紀70年代以來，與DNA、RNA操作相關的各種分子生物學技術不斷開展，到目前曾經構成了一個龐大而復雜的技術體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學研討的重要手段。簡單地說，基因操作就是一切涉及到DNA、RNA操作的技術。本章主要討論如何對基因進展定性、定量分析；在隨后的2章里分別引見基因功能研討的技術和基因工程的有關內容。第六章基因分析的根本戰(zhàn)略1、需求進展基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術3、研討基因在基因組中的拷貝數(shù)：SouthernBlot4、研討基因表達程度：NorthernBlot、逆轉錄實時PCR技術5、研討基因表達產物的程度：WesternBlot、流式細胞儀〔FACS〕對一個知或未知基因的內容進展研討步驟：第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進展研討一、DNA序列測定可以提示基因和基因組一級構造變化DNA測序技術：1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學裂解法3、PCR測序技術4、全自動DNA測序儀這些技術的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸〔2ˊ,3ˊ-ddNTP〕作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位短少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基構成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個核苷酸縮合，導致多核苷酸鏈的延伸終止。

假設在DNA的合成反響中，參與一種少量的ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將在隨機的位點終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的DNA合成反響中，分別參與4種不同的ddNTP，結果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個A，G，C，T的位置上。對這4組核苷酸鏈進展高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理根本步驟：1、先將DNA的末端之一標志放射性同位素〔32P、35S〕，2、再將DNA樣品分別進展多組具堿基特異性、隨機的、不完全的化學修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學試劑在修飾堿基位置斷開DNA鏈；4、經過具有可分辨鏈長短僅一個核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小別分開5、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標志片段分布情況，直接讀出DNA序列。化學裂解法〔Maxam-Gilbert〕1977反響體系堿基修飾堿基修飾主鏈斷裂斷裂點試劑反響試劑

G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G/AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C/TC肼〔加鹽〕胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C在化學修飾反響中，經過控制反響溫度和反響時間，只需一小部分堿基被修飾，隨后進展斷裂反響也是定量。5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼〔加鹽〕DNA自動測序儀上述兩種方法都不順應大規(guī)模DNA測定需求。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺陷，特別是讀結果的讀片過程。1987年發(fā)明了一種準確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動測序儀?！灿脽晒馊玖辖Y合引物〕。隨后又發(fā)明了終止標志系統(tǒng)法。1、提示基因和基因組一級構造變化在醫(yī)學研討中具有重要意義。2、經過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、經過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、經過DNA序列測定對定點突變進展確認。

DNA序列測定的意義分析基因拷貝數(shù)變化一、Southernblot檢測基因拷貝數(shù)變化Southernblot印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分別的待測DNA片段轉印并結合到一定的固定支持物上，然后用標志的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。1975年英國愛丁堡大學的Southern建立了該方法，Southern印跡雜交由此得名。Southernblot步驟〔1〕待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當?shù)南拗菩詢惹忻赶饣蚪MDNA，成大小不一的DNA片段?！?〕待測DNA樣品的電泳分別?！?〕凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段一直堅持雙鏈構造。電泳終了后DNA變性并轉移到適當?shù)墓潭ㄖС治锷喜鸥蛇M展Southernblot。變性通常用堿變性法?！?〕Southern轉膜：將凝膠中的DNA進展堿變性并將PH恢復中性后，即可將凝膠中DNA轉移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素〔NC〕膜、尼龍膜、化學活化膜和濾紙等。轉移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉印跡法、真空轉移法?！?〕知序列的DNA探針的制備〔6〕Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進展雜交前，必需先進展一個預雜交的過程。由于可以結合DNA的膜同樣可以和探針DNA結合，在進展雜交實驗前，必需將膜上一切能與DNA結合的位點全部封鎖?！?〕雜交結果的檢測：采用核素標志的探針或發(fā)光劑標志的探針進展雜交時，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經沖洗，在X線片上可見黑色條帶。1、對某種生物體基因組拷貝數(shù)研討，需求完好提取出基因組，并需求適當?shù)南拗菩詢惹忻该盖校?、通常要研討的基因序列是知的。Southernblot檢測基因拷貝數(shù)本卷須知二、采用PCR技術也可以分析基因拷貝數(shù)原理：細胞內DNA復制是一個復雜過程。參與復制的有多種要素。PCR是在試管中進展的DNA復制反響，PCR原理與細胞內DNA復制類似，但反響體系相對簡單。PCR反響體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及適宜的緩沖液體系。PCR反響的根本過程：變性、退火、延伸PCR技術對擴增的模板濃度雖然很低，擴增產量以一個恒定的指數(shù)率上升，但經過25至30個循環(huán)，產量會到達一個平臺期，同時PCR過程中，還會出現(xiàn)“試管效應〞，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術來鑒定。近年來，隨著PCR技術的不斷改良，如差別顯示PCR和實時PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾〔polyA〕構造，因此可用含oligo〔dT〕的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。根據(jù)PolyA序列起點前2個堿基除AA外只需12種能夠性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物；同時為擴增出polyA上游500bp以內一切能夠性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進展PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進展Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差別條帶鑒定分析，以便最終獲得差別表達的目的基因。〔1〕差別顯示PCR用于基因拷貝數(shù)分析雖然運用

差別顯示PCR方法曾經獲得了不少成果，而且該方法還在不斷改良之中，但它依然存在幾個難以處理的問題：但它依然存在幾個難以處理的問題：(1)反復率低，至少有20%的差別條帶不能被準確反復；(2)假陽性率可以高達90%；(3)獲得的差別表達序列極少包含編碼信息。〔2〕、代表性差別分析技術該技術是將差減雜交與PCR有機結合構成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(tester)mRNA逆轉錄成cDNA片段群,接上接頭進展第一次PCR擴增;2、將兩組PCR產物片段群用限制性內切酶酶切,構成平均長度256bp的長度.3、將接頭消化,在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合.過量的driver可與tester中互補的部分構成雙鏈.4\復性,按新接頭序列設計引物進展第2輪PCR，只需tester和tester雜合體才干和引物配對,大量拉增.實時PCR根據(jù)PCR反響動力學特點設計的分析方法。在PCR反響的初始階段，反響體系中的模板的產物深度較低，而引物是過量的，產物和模板復性不會構成與引物競爭，此時產物含量呈指數(shù)添加。當PCR產物積累后，產物的復性可以競爭引物與模板的結合，產物添加減慢，最后進入平臺期。所以對樣品中的cDNA進展定量分析的最正確時期是反響早期。有人試圖依托循環(huán)次數(shù)減少來分析樣品中的cDNA含量，但因樣品的差別使之很不可靠。在一定的循環(huán)中，mRNA豐度低的樣品產量少，能夠尚不能檢測，豐度高的樣品能夠已進入平臺期，故難以較。〔3〕實時PCR用于基因拷貝數(shù)分析實時PCR原理是：在PCR反響體系中參與一種雙色熒光標志的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號的變化計算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)在寡核苷酸探針的5`端標志一個報告熒光染料，3`端標志一個猝滅染料。當光源照射到探針時，被激活的報告熒光染料將能量轉移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當PCR產物擴增時，聚合酶遇到結合在模板上的熒光探針時，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，將兩種染料分別，因此根據(jù)報告熒光所發(fā)射的熒光強度與被切探針成正比，由此可以計算出PCR產物的含量。實時PCR技術特別適宜于低拷貝基因的定量。實時PCR需求包括熱循環(huán)儀、計算機、光學儀器用于熒光激發(fā)和搜集器、數(shù)據(jù)處置和分析軟件。核酸堅持在細胞或組織切片中，經適當方法處置細胞或組織后，將標志的核酸探針與細胞或組織中的核酸進展雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需求從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完好堅持組織與細胞形狀，更能準確反映出組織細胞的相互關系及功能形狀。三、原位雜交技術可以分析基因在染色體上位置根據(jù)檢測對象不同可將原位雜交分為細胞內原位雜交和組織切片原位雜交。同時原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而以。核酸探針根據(jù)標志方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標志探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺陷，非放射性探針可以用生物素、地高辛、熒光素標志探針。〔一〕、固定：堅持細胞構造，最大限制地堅持細胞內DNA或RNA的程度；使探針易于進入細胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑〔如戊二醛〕?！捕场⒉Ｆ徒M織切片的處置：包括玻片處置、細胞組織切片的處置、降低背景、預雜交?！踩畴s交：調整探針的濃度〔0.5～5.0ng/μl〕、探針長度〔50～100個堿基〕、雜交的溫度和時間〔四〕雜交后處置：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗?！参濉筹@示：根據(jù)核酸探針標志物的種類分別進展放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進展不同顯色處置?！擦辰Y果分析根本方法真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研討中，以mRNA研討最為熱點。它的研討可以提示基因的構造、基因的活性、或基因的變異等。mRNA研討常用的方法有Northernblot、原位雜交、實時PCR、RNA酶維護實驗、cDNA芯片技術和RT-PCR。第二節(jié)利用RNA定性定量分析可從不同角度提示基因表達活性Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經電泳分別后轉移到固定支持物上，然后與標志的核酸探針進展固-液相雜交。原理同Southernblot。但因Northernblot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時，所需器皿均需求特殊處置。同時作為監(jiān)測細胞內RNA含量不夠準確，只能作為定性分析RNA方法?！惨弧砃orthernblot定性分析RNA的常用方法RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴增cDNA的技術。其根本程序是：提取細胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，進展特定基因的PCR擴增。由于PCR擴增產物有平臺效應，故RT-PCR也普通用于RNA的定性分析。但假設將陽性參照基因作為內參照與待測RNA在一個反響體系中進展擴增，可以對RNA進展相對定量分析。參照基因：β-肌動蛋白〔β-actin〕、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等?！捕砇T-PCR用于定性、定量分析RNA方法三、RNA酶維護實驗—了解基因轉錄后的選擇性剪接RNA酶維護實驗是利用RnaseA和RnaseT1能專注的降解單鏈RNA而雙鏈RNA遭到維護的特性，用體外轉錄合成的放射性核素標志的RNA探針與待檢測mRNA進展液相雜交，使RNA探針和待測RNA間在互補序列處構成雜交體，然后用RnaseA和RnaseT1切割此RNA雜交體，遭到維護的RNA經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，從而估計待檢測mRNA情況。RNA酶維護實驗：可用于①mRNA定量、②mRNA末端定位、③mRNA剪切部位④確定內含子在相應基因中的位置。RNA酶維護實驗：全新的mRNA定量分析方法其根本原理是將標志的特異RNA探針〔32P或生物素〕與待測的RNA樣品液相雜交，標志的特異RNA探針按堿基互補的原那么與目的基因特異性結合，構成雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化構成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合后構成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶維護實驗。監(jiān)測大量基因表達的最好方法之一是cDNA微陣列技術，利用這種技術可以同時測定成千上萬個基因的轉錄活性。cDNA微陣列技術的根本原理與核酸分子雜交方法是一樣的。都是運用知核酸序列作為探針與互補的靶核酸序列雜交，經過隨后的信號檢測進展定性或定量分析基因的表達情況。利用cDNA微陣列能在同一時間內平行分析大量的基因轉錄產物，進展大量的信息挑選和檢測分析。三、cDNA微陣列〔cDNA芯片〕可同時分析大量基因的轉錄活性目前研討蛋白質的技術普通多采用免疫印記技術〔Western