動物細(xì)胞工程

動物細(xì)胞工程

就是從動物機體中取出相關(guān)組織，將它分散成單細(xì)胞，然后,放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和繁殖。1、概念：一、動物細(xì)胞培養(yǎng)動物胚胎或幼齡動物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個細(xì)胞加培養(yǎng)液細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞部分細(xì)胞“癌變”，無限傳代動物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成動物體50代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁剝離、分瓶細(xì)胞2、培養(yǎng)過程：分化程度低，增殖能力強去掉組織間蛋白3、幾個重要的概念細(xì)胞貼壁懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上(單層)。要求：培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。接觸抑制

細(xì)胞在貼壁生長過程中，隨著細(xì)胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個單層，此時細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長停止，這時如果要使細(xì)胞繼續(xù)生長，就要及時用胰蛋白酶等，使細(xì)胞從瓶壁上解離下來，然后加入新的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分離稀釋，并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)的過程。

把第1代細(xì)胞的培養(yǎng)與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。

細(xì)胞株

傳到40-50代后有部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，具有癌細(xì)胞的特點，失去接觸抑制，可能在培養(yǎng)條件下無限制的傳代下去。

從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出進行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，能傳到40-50代，其遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生變化。

細(xì)胞系細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系細(xì)胞貼壁生長隨細(xì)胞增多，出現(xiàn)接觸抑制部分細(xì)胞癌變，失去接觸抑制，無限傳代4、動物細(xì)胞培養(yǎng)條件能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清、微量元素等）溫度和PH溫度36.5+0.5度，pH7.2～7.4氣體環(huán)境O2和CO2（95%空氣和5%CO2）離體培養(yǎng)的細(xì)胞對微生物和有毒物質(zhì)沒有防御能力。保證細(xì)胞順利的生長增殖CO2培養(yǎng)箱

哺乳動物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣,需要在恒足溫度下才能生存,溫差變化一般不應(yīng)超過0.5度，因此培養(yǎng)箱對溫度應(yīng)具有較高靈敏度。

CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點在于能恒定地供應(yīng)一定量的CO2,一般5%即可維持培養(yǎng)液PH值穩(wěn)定。培養(yǎng)基的類型天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：營養(yǎng)價值高，成分復(fù)雜。成分明確，便于控制試驗條件。5、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等；（4）用于檢測有毒物質(zhì)；（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮；（3）作為基因工程的受體細(xì)胞;（5）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)。6、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體快速繁殖、培育無病毒植株等葡萄糖、動物血清促生長因子蔗糖、植物激素液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基細(xì)胞增殖1、在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞是（）

A．細(xì)胞系B．細(xì)胞株

C．原代細(xì)胞D．傳代細(xì)胞2、動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是（）

A.動物細(xì)胞融合B.單克隆抗體

C.胚胎移植D.動物細(xì)胞培養(yǎng)AD3、用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的組織和細(xì)胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細(xì)胞（）

A.容易產(chǎn)生各種變異B.具有更強的全能性

C.取材十分方便D.分裂增殖的能力強D4.動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于（）A.培養(yǎng)基不同；B.動物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行；C.動物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能；D.動物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株。D二、克隆技術(shù)一般指DNA分子擴增。由一個細(xì)胞分裂所形成的細(xì)胞群體。指基因型完全相同的個體或群體。分子水平：細(xì)胞水平：個體水平：

克隆就是無性繁殖，具體地說，是指一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產(chǎn)生出來的一群遺傳特性相同的DNA分子、細(xì)胞或個體。動物細(xì)胞特點分化潛能變窄：

隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是就細(xì)胞整體而言。細(xì)胞核仍具有全能性：

細(xì)胞核含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細(xì)胞分化而丟失基因，因此高度分化細(xì)胞的細(xì)胞核仍具有全能性。1997年英國伊斯維姆.穆特等運用羊的體細(xì)胞（乳腺細(xì)胞）克隆出了羊—克隆羊“多莉”。細(xì)胞分化程度

，恢復(fù)全能性

。核移植（難度高）三、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植細(xì)胞分化程度

，恢復(fù)全能性

。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物。1.概念：

將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。低容易高困難卵母細(xì)胞黑面母綿羊白面母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞核移植早期胚胎C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵母細(xì)胞2.體細(xì)胞核移植過程卵原細(xì)胞卵細(xì)胞卵原細(xì)胞卵細(xì)胞和極體次級卵母細(xì)胞第一極體MⅡ期：減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞作受體細(xì)胞的原因：體積大，易操作；含有激發(fā)細(xì)胞核全能性的物質(zhì)。去核的方法有哪些？

目前核移植技術(shù)中普遍使用的去核方法是顯微操作去核法。還有人采用其他方法，如梯度離心、紫外光短時間照射、化學(xué)物質(zhì)處理等。這些方法是在沒有刺破透明帶或卵母細(xì)胞質(zhì)膜的情況下，去除細(xì)胞核或使卵細(xì)胞核DNA變性，從而達到去核目的。細(xì)胞核核移植供體細(xì)胞（供核）細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞卵母細(xì)胞（MⅡ期：供質(zhì)）去核無核卵母細(xì)胞注入細(xì)胞融合重組細(xì)胞重組胚胎胚胎移植代孕母體與供體奶牛遺傳基礎(chǔ)相同的犢牛2.體細(xì)胞核移植過程分娩妊娠激活四、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1、加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育2、保護瀕危物種，增加存活數(shù)量3、克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白4、可以作為異種移植的供體，可以用于組織器官的移植五、體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題胚胎移植后動物幼體產(chǎn)出概率＜10％；克隆動物存在著健康問題；克隆動物的食品安全性問題存在爭議。

2.2.2動物細(xì)胞融合與單克隆抗體

為什么“甲流”康復(fù)者或接種疫苗1月以上者的血漿會成為救治重癥“甲流”患者的妙藥？

血漿中的抗體會與“甲流”病毒反應(yīng)，從而將病毒消滅。獲得抗體的傳統(tǒng)方法

把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需的抗體。缺點：

人們發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞盡管可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每一個B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。怎樣才能獲得大量的單一性抗體呢？產(chǎn)量低純度低特異性差怎樣才能獲得單一性抗體？大量克隆單一的B淋巴細(xì)胞其壽命僅有幾天，無法長期體外培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)骨髓瘤細(xì)胞無限增殖雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體無限增殖細(xì)胞融合G.Kohler

C.Milstein

英國科學(xué)家米爾斯坦和科勒于1975年設(shè)計和實踐了這個想法，并獲得成功。摘得1984年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：

動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。

融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。2、動物細(xì)胞融合基本原理細(xì)胞膜的流動性3、誘導(dǎo)方式物理法：化學(xué)法：生物法：滅活的病毒電激、振動、離心聚乙二醇（PEG）如：仙臺病毒為什么要用滅活的病毒？仙臺病毒物理/化學(xué)方法喪失感染活性保留融合活性

滅活的病毒滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞4、植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)方法用途獲得雜種植株細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）制備單克隆抗體滅活的病毒二、單克隆抗體的制備用抗原免疫小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合多種細(xì)胞由于培養(yǎng)基中缺乏相應(yīng)的營養(yǎng)物，骨髓瘤細(xì)胞死亡B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)幾天后死亡雜交瘤細(xì)胞置于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)用培養(yǎng)液稀釋注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)

由單個雜交瘤細(xì)胞通過克隆，所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體。單克隆抗體整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：第二次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。三、單克隆抗體的特點和應(yīng)用“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物診斷試劑用于治療疾病1、特點：特異性強，靈敏度高，產(chǎn)量高。2、應(yīng)用：用于運載藥物優(yōu)點：準(zhǔn)確，高效，快速練習(xí)1、動物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是（）

A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體

C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞B2、單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的（）

A.B淋巴細(xì)胞B.T淋巴細(xì)胞

C.骨髓瘤細(xì)胞D.雜交瘤細(xì)胞D3、單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（）①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞

A.②④B.①③⑤C.①②③④D.②③CB體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

4、下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實驗方案制備單克隆抗體不能，沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細(xì)胞。(1).該實驗方案的目的是：________________(2).該方案能達到預(yù)期效果嗎？為什么？(3).A是從小鼠的脾臟中取得__________該細(xì)胞能夠產(chǎn)生______。(4).圖中B為________________過程，常用_________________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________。(5).C過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括