轉(zhuǎn)基因動植物課件

轉(zhuǎn)基因(transgenic)動植物就是用基因工程的方法將人們需要的外源目的基因?qū)雱?、植物體內(nèi)，整合到動、植物的染色體上，與內(nèi)源基因在一起，隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制，在生物體內(nèi)得到表達(dá)，并能穩(wěn)定地遺傳。整合到動植物基因組上的外來結(jié)構(gòu)基因稱為轉(zhuǎn)基因(transgene)，由轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)稱為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物影響動物性狀。

第七章轉(zhuǎn)基因動植物1轉(zhuǎn)基因?qū)⑸婕暗饺祟惖幕蛑委煛⑥D(zhuǎn)基因食品、體細(xì)胞克隆、以及農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和藥物、食品工業(yè)的微生物育種和生物制藥的發(fā)生器等。其目的無非是治療遺傳病，改良動植物品種，提高食品的營養(yǎng)價值和生產(chǎn)更好更廉價的藥物，提高人類的生活質(zhì)量。2

用基因工程技術(shù)來產(chǎn)生四類轉(zhuǎn)基因生物:①科學(xué)家們用P因子轉(zhuǎn)化果蠅，來研究胚胎發(fā)育；②通過轉(zhuǎn)染和生物射彈（biolistics）對植物進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染；③制備人類疾病的動物模型；④產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家畜。其他兩種轉(zhuǎn)基因模型生物是線蟲（C.elegans）和小型熱帶魚類—斑馬魚(Daniorerio)。3第一節(jié)

果蠅發(fā)育的分子生物學(xué)分子克隆技術(shù)一開始一些遺傳學(xué)者就制備了一系列果蠅的突變品系，他們利用這些突變體在果蠅基因組中對特定基因進(jìn)行物理定位。先用RNA印跡來研究基因表達(dá)，并用原位分子雜交來進(jìn)行定位。直到將克隆DNA插入到果蠅的生殖細(xì)胞中人們才能開始了解發(fā)育過程是怎樣控制的。

4

一、P因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)座因子含有兩個功能區(qū)：（1）轉(zhuǎn)座因子兩端的DNA重復(fù)序列，此是整合和切離所需要的；（2）編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA序列，此是轉(zhuǎn)座所需要的。

A.Spradling

和G.Rubin根據(jù)在其他系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座因子的研究，論述了克隆的P因子序列可用于構(gòu)建果蠅的表達(dá)載體，誘導(dǎo)克隆的DNA的“終末”轉(zhuǎn)座到果蠅的生殖細(xì)胞中。他們使用的技術(shù)是用鑒別轉(zhuǎn)座基因的標(biāo)記基因和待測定的實(shí)驗基因取代克隆P因子中的轉(zhuǎn)座酶編碼序列。5基因調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)座酶雌蠅雄蠅收集受精卵將質(zhì)粒DNA直接微注射入卵中10天(a)P因子轉(zhuǎn)座是用純化的質(zhì)粒DNA共注射果蠅的胚胎，使其整合到生殖系DNA中的方法。P因子轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是一種編碼眼色素的序列。它可通過玫瑰紅眼(ry+)用來鑒別轉(zhuǎn)基因，相反，未轉(zhuǎn)化的果蠅是白色眼(ry-)。G0G1

CAATSP1AP16G4(a)在這個例子中，調(diào)節(jié)區(qū)插在表達(dá)的發(fā)育基因（ry+）5'端lacZ報導(dǎo)基因的上游。帶有玫瑰紅（ry+）眼的第二代雌蠅(G1)中每個細(xì)胞都含有P因子，并可用來控制lacZ報導(dǎo)基因在早期胚中的表達(dá)。鑒別帶有單個P因子插入的果蠅，與G1果蠅回交產(chǎn)生純合的同基因品系。正如例中所示，在早期胚中，內(nèi)源靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和lacZ

報導(dǎo)基因相同，表明克隆的靶基因調(diào)節(jié)區(qū)是完全有功能的。7在轉(zhuǎn)入lacZ基因的雌蠅和缺陷型雄蠅(不能產(chǎn)生早期胚發(fā)育所需的轉(zhuǎn)錄因子)之間進(jìn)行雜交，能用來測定轉(zhuǎn)錄因子控制的靶基因的特異性表達(dá)8

二、P因子增強(qiáng)子阱載體

增強(qiáng)子阱(enhancertrap)是將某報導(dǎo)基因與一個最小化的啟動子相偶連，組成一增強(qiáng)子阱重組體，即該啟動子能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合但活性很低，而需由被插入的增強(qiáng)子幫助才可正常轉(zhuǎn)錄。如果增強(qiáng)子捕獲重組體整合進(jìn)增強(qiáng)子的作用區(qū)域，那么啟動子的活性就會激增，使報導(dǎo)基因得到充分表達(dá)，則可推知插入位點(diǎn)附近有增強(qiáng)子存在，即以該增強(qiáng)子阱重組體來探測增強(qiáng)子是否的目的。910品系1品系2產(chǎn)生獨(dú)立的Gal4增強(qiáng)子捕獲品系弱啟動子區(qū)轉(zhuǎn)座酶11品系1品系2Gal4結(jié)合位點(diǎn)Gal4待測品系

翅特異增強(qiáng)子阱

腹部特異增強(qiáng)子阱12

Gal4

增強(qiáng)子阱方法是用通過篩選轉(zhuǎn)基因果蠅來鑒別細(xì)胞特異增強(qiáng)子，這些果蠅表現(xiàn)出Gal4控制的

IacZ基因的有限表達(dá)

。在此例中，

品系1

在翅膀特異基因附近插入了Gal4

增強(qiáng)子阱；品系2在腹部體節(jié)基因中插入了一個轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。鑒別細(xì)胞特異增強(qiáng)子阱果蠅品系對于研究靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)異常是有用的方法。

Gal4

增強(qiáng)子捕獲的插入通過破壞基因能導(dǎo)致表型突變，通過重新獲得Gal4基因鄰近的基因組序列提供了一種鑒別發(fā)育基因的方法。13三、可介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的其他真核轉(zhuǎn)座因子

（一）、水手因子(marinerelement)

水手因子是由H.M.Robertson于1993年從果蠅中鑒別出的轉(zhuǎn)座因子，并發(fā)現(xiàn)存在于多種昆蟲中。水手因子末端為28bp的反向重復(fù)序列。中間是編碼含有345aa的轉(zhuǎn)座酶。14（二）、睡美人（SleepingBeauty，SB）

SB是水手轉(zhuǎn)座因子超家族中的一員，長1.6kb,兩側(cè)是231bp的IR。中央?yún)^(qū)編碼一個轉(zhuǎn)座酶和DNA識別區(qū)。它能夠?qū)⒆约翰迦氲交蚧蚧蛑g，活化或關(guān)閉一個基因的正常功能。實(shí)驗證明，SB能將外源基因插入到脊椎動物培養(yǎng)細(xì)胞中，包括小鼠的胚胎干細(xì)胞及人類細(xì)胞。

轉(zhuǎn)座因子睡美人的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15（三）、PB(piggyback

)因子

PB因子(PBelement)屬于真核生物的第二類轉(zhuǎn)座子，“PB”是“piggyback(卡車拖車)”的縮寫。其來源于粉紋夜蛾(Trichoplusia)，是一個自主因子，長2.5kb，兩端有長為13bp短的反向重復(fù)序列（IR），另外還存在不對稱地分布的內(nèi)部反向重復(fù)序列(19bp)，中央?yún)^(qū)有一個長2.1kb可讀框，編碼轉(zhuǎn)座酶。16

2005年TianXu（許田）等成功改造了來源于飛蛾的PB因子并將其應(yīng)用于哺乳動物。PB可在人和小鼠細(xì)胞株中高效導(dǎo)入基因并穩(wěn)定表達(dá)，為體細(xì)胞遺傳學(xué)研究和基因表達(dá)提供了一個高效、便捷的新系統(tǒng)。17Dr.XuisalsoprofessorandvicechairmanofgeneticsatYaleSchoolofMedicine,directoroftheMouseFunctionalGenomeProject,andadjunctprofessoranddirectoroftheFudan-YaleBiomedicalResearchCenteratFudanUniversity.TianXu,PhD

181920

第二節(jié)

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的農(nóng)作物

提高農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量的有兩方法。一是雜交育種，但不可能將所有的優(yōu)良性狀組合到一種植物中。二是用殺蟲劑和除草劑。長期使用化學(xué)藥物會導(dǎo)致環(huán)境的破壞。而用轉(zhuǎn)基因的方法能克服以上的問題。達(dá)到增加產(chǎn)量，改進(jìn)質(zhì)量并可抗病蟲害以及抗干旱、鹽堿等。有兩種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的常用方法：（1）通過根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙子葉植物；（2）用基因搶等裝置發(fā)出高速粒子轟擊單子葉植物等

。21

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(吸收裸露的DNA)聚乙二醇(PEG)

原生質(zhì)體融合或在Ca2+離子和聚乙二醇存在的情況下直接吸收DNA。在植物中，需要從原生質(zhì)球/原生質(zhì)體中重新產(chǎn)生細(xì)胞，雖有效，但費(fèi)力。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

DNA與陽離子脂質(zhì)體形成復(fù)合物，被內(nèi)吞吸收。是植物原生質(zhì)球/原生質(zhì)體的高效方法。電穿孔通過高電壓短暫沖擊產(chǎn)生瞬時小孔吸收裸露的DNA。是轉(zhuǎn)染酵母、植物和動物細(xì)胞非常有效的方法。22

微彈(生物彈)

以鎢或金的顆粒包被DNA，用基因槍(genegun)高速打入細(xì)胞(原先是改進(jìn)的短槍，但近來發(fā)展了用空氣或放電的高壓沖擊波更精制的裝置)。不需要去除細(xì)胞壁，能對植物細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染。也能用于轉(zhuǎn)染整個植物組織。接合方法(DNA通過細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中)

Ti載體用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒切得的T-DNA轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的活體植物和植物細(xì)胞。重組的T-DNA是高效的基因轉(zhuǎn)移載體，盡管只有雙子葉植物能被轉(zhuǎn)化。23一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

根農(nóng)癌桿菌可在植物的創(chuàng)傷處產(chǎn)生冠癭瘤（crowngalltumors），通過此可鑒別根農(nóng)癌桿菌的感染。根農(nóng)癌桿菌最好的品系是A.tumefaciens，通過轉(zhuǎn)移機(jī)制它可以傳輸25kb左右的DNA，進(jìn)入到植物細(xì)胞中。此短片段DNA稱為轉(zhuǎn)移DNA（transferDNA,T-DNA），即Ti質(zhì)粒中可轉(zhuǎn)入植物基因組的DNA片段。這類似于細(xì)菌的接合（conjugation），植物組織創(chuàng)傷區(qū)域釋放的植物激素的刺激導(dǎo)致了接合的產(chǎn)生。24Ti質(zhì)粒有四個保守區(qū)

Ti質(zhì)粒（Ti-plasmid）為長200kb左右的單拷貝A.tumefaciens

質(zhì)粒，有4個主要的功能域：（1）T-DNA：攜帶植物激素基因和章魚堿基因；（2）vir區(qū)域：侵入性基因（virulencegenes）（3）接合基因：和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移有關(guān)（4）冠纓堿利用。25T-DNA冠癭堿合成基因vir致瘤oriTi質(zhì)粒冠癭堿代謝基因細(xì)胞分裂素基因生長激素基因RHLH200kbTi(tumour-induced)質(zhì)粒，根據(jù)不同株系，其大小變化在5-450kbp之間。有兩類Ti質(zhì)粒，分別誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的冠纓堿，章魚堿(octapines)或胭脂堿(nopalines)。Ti質(zhì)粒一般都有四個保守區(qū)域：（1）T-DNA，攜帶植物激素基因和章魚堿基因；（2）是毒性基因vir(virulence)區(qū)域。（3）攜帶接合基因，與細(xì)菌間質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移有關(guān)。（4）編碼功能與冠纓堿利用有關(guān)。26天然的Ti質(zhì)粒不能使用。（1）可產(chǎn)生腫瘤。可采用破壞或刪除腫瘤基因來解決。（2）太大，不便操作。可用兩種策略來解決：

a.將T-DNA克隆到中間載體上操作后再導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，與內(nèi)源性Ti質(zhì)粒重組。

b.將T-DNA和vir基因分別克隆在兩個小質(zhì)粒上。27冠癭瘤28中間載體消除的Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒消除的Ti質(zhì)粒共合體質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因植物的染色體(a)重組消除轉(zhuǎn)化29煙草植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)移植轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(a)為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，中間載體的大小以易于克隆插入片段為宜。中間載體與消除的Ti質(zhì)粒重組而產(chǎn)生的共合體結(jié)構(gòu)，此質(zhì)粒在邊界間插入了一個可選擇的卡那霉素抗性標(biāo)記。(b)通過T-DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。30vir區(qū)控制T-DNA轉(zhuǎn)移的過程。

vir區(qū)有virA和virG兩個基因。virG編碼對受傷植物釋放的酚類化合物作出應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子。virA編碼受配基刺激自身磷酸化的受體，并將磷酸基轉(zhuǎn)移給VirG。VirG是vir基因座上的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)vir下游基因

virD1,virD2和virE2基因轉(zhuǎn)錄。

virD1,virD2合成內(nèi)切酶。

T-DNA序列的兩側(cè)有兩個25bp長的短重復(fù)序列元件，稱為T-DNA的右邊界（rightborder，RB）序列和左邊界（leftborder，LB）序列。31

在T-DNA轉(zhuǎn)移的過程中，VirD1,

VirD2蛋白能識別RB和LB序列。

超驅(qū)動序列(overdrive)是鄰近右手邊界的序列，它通過與VirC蛋白特異的相互作用，指導(dǎo)內(nèi)切酶到達(dá)邊界序列，促進(jìn)

T-DNA邊界序列的缺口剪切，從而增強(qiáng)

T-DNA的轉(zhuǎn)移。32

在T-DNA轉(zhuǎn)移的過程中，VirD1,VirD2蛋白能識別RB和LB序列。

超驅(qū)動序列(overdrive)是鄰近右手邊界序列，它通過與VirC蛋白的特異相互作用，指導(dǎo)內(nèi)切酶到達(dá)邊界序列，促進(jìn)

T-DNA邊界序列的缺口剪切，從而增強(qiáng)T-DNA的轉(zhuǎn)移。33T-DNATi質(zhì)粒DNAVirD1/2內(nèi)切酶virtraVirE2與DNA結(jié)合(核定位信號)

植物DNA植物細(xì)胞核RHLH精密的RH邊界可變的LH邊界VirGPPVirA酚類化合物RHLHVirD1/2VirE2

34重組體T-DNA質(zhì)粒載體除了LB和RB以外，還含有一些功能單位：①宿主的復(fù)制區(qū)ori；②可供在細(xì)菌中選擇的抗性標(biāo)記，如卡那霉素抗性基因(kanr)等；③在LB和RB之間的多克隆位點(diǎn)(MCS)，供外源基因插入；④帶有植物顯性選擇標(biāo)記基因的啟動子，供選擇再生植物之用。35通過電穿孔T-DNA載體進(jìn)入農(nóng)桿菌中并選擇tetr農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染損傷的植物細(xì)胞T-DNA載體根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒36T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的基因組中Ti質(zhì)粒基因產(chǎn)物誘導(dǎo)植物再生并選擇Kanr細(xì)胞生長37

二、用基因搶制備轉(zhuǎn)基因水稻和玉米

大多數(shù)糧食作物都是單子葉植物，如水稻、小麥、玉米等。除少數(shù)之外，單子葉植物是抗根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的，由于在雙子葉植物和單子葉植物之間對于創(chuàng)傷的應(yīng)答反應(yīng)和產(chǎn)生的激素存在著差異。因此，對于單子葉植物的DNA轉(zhuǎn)染方法最初是用DNA微注射和電穿孔來處理原生質(zhì)體（protoplasts）。由于原生質(zhì)體的再生能力弱，嚴(yán)重地影響了轉(zhuǎn)化效率。為了解決這個問題，JohnSanford

建立了一種名為“基因槍法”的單子葉植物轉(zhuǎn)基因的方法。

38生物射彈（biolistics）或稱基因槍

(genegun)法,

這些用爆發(fā)力轉(zhuǎn)染染方法其效率是不受細(xì)胞類型的限制。這種DNA轉(zhuǎn)染法是用金屬鎢包被DNA片段，制備成微彈通過22mm口徑的槍直接發(fā)射來轟擊完整植物的分生組織區(qū)。

3940香港中文大學(xué)生物系辛世文教授與研究人員員利用基因槍進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?142

圖表示兩種生物射彈裝置。

(a)表示生物射彈裝置系統(tǒng)。樣本倉直接放置待轉(zhuǎn)基因的植物秧苗，微彈由金屬鎢或金制成，內(nèi)包有靶基因DNA，微彈射入樣本倉中的隔篩時，這種粒子從微載體中釋放出。氣體基因槍以壓縮氣體（氦或氮）轉(zhuǎn)換成的氣體沖擊波為動力。生物射彈裝置系統(tǒng)有一個產(chǎn)生沖擊波的特殊結(jié)構(gòu)，讓微彈穿越，射入在轟擊室底部的靶細(xì)胞中。

(b)是手提式基因槍，通過調(diào)整He脈沖將包被

DNA或RNA的金粉“子彈”從小塑料管的內(nèi)壁直接推進(jìn)到靶細(xì)胞中。43用基因槍將帶有報告基GUS(細(xì)菌中的β－葡糖醛酸酶基因)的外源DNA射入胡蘿卜組織中(蘭色部分)。44第三節(jié)．轉(zhuǎn)基因小鼠一、用受精卵細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因小鼠兩種轉(zhuǎn)基因方法，建立小鼠模型來研究人類疾病。第一種轉(zhuǎn)基因的方法是將外源DNA微注射到單個的胚細(xì)胞中，產(chǎn)生含有一到多個隨機(jī)插入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因小鼠。第二種方法是在小鼠的基因組特定基因座上通過同源重組取代某些特定的DNA序列。這兩種方法建立于1900年代，AbbieLathrop發(fā)現(xiàn)這種方法對于繁育寵物鼠是有利的。45顯微注射DNA的方法可分兩步進(jìn)行。首先是使雌鼠在預(yù)先確定的時間超數(shù)排卵，通過和種雄鼠交配，產(chǎn)生大量的剛剛受精的單細(xì)胞胚胎。第二步是用手術(shù)收集單細(xì)胞胚胎，經(jīng)短暫的離心處理后，在顯微操作儀下，用一種顯微操作針將1皮升含有500～600拷貝線性化DNA的分子緩沖溶液注入到受精卵的雄原核（malepronuclei）中，然后將此卵移植到假孕的雌性小鼠子宮內(nèi)，三周后生下幼鼠，剪斷幼鼠的尾巴，從尾巴中分離DNA供PCR分析,以確定是否存在轉(zhuǎn)入的DNA序列。46負(fù)壓正壓DNA微注射針DNA顯微操作儀卵顯微操作儀卵固定管倒置顯微鏡皮克注射控制器注射器用顯微操作儀和DNA微注射針將純化的外源DNA直接注入到小鼠受精卵的雄原核中。(a)胚胎注射的三種基本的儀器是放大率為400倍的導(dǎo)置顯微鏡，裝有帶負(fù)壓持卵針的顯微操作儀（左）和裝有DNA微注射針的顯微操作儀。47負(fù)壓極體雌原核細(xì)胞膜DNA注入到雄原核中核仁透明帶(b)用微注射針將皮克量純化的DNA(1μg/ml)注入固定在固定管上的受精卵的雄原核中。48

轉(zhuǎn)基因“建立者”小鼠和同窩中的非轉(zhuǎn)基因小鼠回交通過PCR陽性來鑒別出第一代陽性小鼠。

(a)將經(jīng)注射激素，超數(shù)排卵的雌鼠和種雄鼠交配，然后分離受精卵，將DNA顯微注射入受精卵細(xì)胞中。顯微注射20～30個受精卵，然后移植入假孕雌鼠的子宮中，19天后生產(chǎn)5～8個左右的幼鼠。3周后從同窩的轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴中采樣，通過PCR分析鑒別陽性小鼠。49轉(zhuǎn)基因DNAPCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的產(chǎn)物用EB染色凝膠種雄鼠超數(shù)排卵雌鼠分離受精卵將轉(zhuǎn)基因DNA顯微注射入卵中19天G0幼鼠3周從尾巴中分離DNA供PCR分析用對照組PCR產(chǎn)物將經(jīng)顯微注射的卵植入假孕雌鼠的子宮中50回交M4小鼠的生殖細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)基因DNAM2小鼠是建立者動物通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的產(chǎn)物G1幼鼠(b)通過PCR分析鑒別出的陽性小鼠與非轉(zhuǎn)基因鼠回交來鑒別含有生殖系DNA整合建立者動物。

51在轉(zhuǎn)基因小鼠中，細(xì)胞特異啟動子能在特異類型組織中表達(dá)外源基因。圖中的實(shí)驗表示前列腺特異啟動子能被用來產(chǎn)生前列腺癌的轉(zhuǎn)基因鼠模型。由于DNA整合到小鼠的基因組中的特定區(qū)域，影響轉(zhuǎn)基因啟動子特異表達(dá)。經(jīng)RNA印跡分析可鑒別帶有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)模式(PO2)的“建立者”小鼠。研究了“建立者”子代小鼠的經(jīng)前列腺組織可以確定那些是人類前列腺癌的轉(zhuǎn)基因模型鼠。

52顯微注射受精卵通過回交和PCR分析鑒別建立者小鼠從“建立者”鼠的肝、腎和前列腺中分離RNA,并通過RNA印跡分析PO3PO1PO4PO253癌基因轉(zhuǎn)錄本肌動蛋白PO2“建立者”品系具有特異的前列腺癌基因表達(dá)PO2雌鼠沒有卵巢腫瘤PO2雄鼠在青春期前沒有前列腺腫瘤PO2成年雄鼠具有有大的前列腺腫瘤54二、通過干細(xì)胞的同源重組進(jìn)行基因敲除

在“敲除(knockout，KO)”小鼠產(chǎn)生之前有兩種方法取得了突破，這兩種關(guān)鍵的發(fā)明是：（1）培養(yǎng)多潛能性小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstem，ES)

，它能和非轉(zhuǎn)基因鼠的囊胚組合；（2）建立了DNA克隆載體和篩選細(xì)胞系的方法，使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和外源DNA經(jīng)歷了同源重組。55細(xì)胞被轉(zhuǎn)染新霉素類似物GCV9-鳥嘌呤藥物前導(dǎo)物培養(yǎng)基56定向突變(targetedmutation)或敲除。(1)在體外將neor基因插入到克隆基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)中，使其失去活性，構(gòu)建成尋靶載體。(2)將帶有雙標(biāo)記的載體導(dǎo)入到從小鼠胚分離出的細(xì)胞中。(3)結(jié)果會發(fā)生三種情況:

(a)一是載體上的插入了neor標(biāo)記的外源基因與細(xì)胞內(nèi)正常的同源基因發(fā)生同源重組，使染色體上帶有了定向插入基因，同時也插入了neor標(biāo)記基因，而tk

基因仍然留在載體上，未能插入到染色體上（上）；

(b)整個的載體隨機(jī)地整合到染色體上，未發(fā)生同源重組，但將雙標(biāo)記都帶到了染色體上（中）。

57(c)載體未能插入到染色體上，更不會產(chǎn)生同源重組，雙標(biāo)記都留在載體上（下）；（4）篩選分離帶有定向突變的細(xì)胞

。將各種細(xì)胞都鋪在含有選擇劑新霉素類似物(G418)和GCV(9-[1,3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤)的培養(yǎng)基上。G418可使細(xì)胞致死，但含有neor基因的細(xì)胞具有抗G418的功能。因此可以排除未被靶基因取代的細(xì)胞。而GCV是有毒的物質(zhì)，當(dāng)單純性皰疹病毒的tk

基因存在時，胸苷激酶可催化GCV作為底物參與DNA的合成，使細(xì)胞致死。因此用它可以排除隨機(jī)整合載體的細(xì)胞。結(jié)果只有定向插入外源DNA的細(xì)胞才能在培養(yǎng)基上存活，增殖。

58棕褐色雄性種鼠超數(shù)排卵棕褐色雌鼠三天后從子宮里分離囊胚在滋養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)囊胚滋養(yǎng)細(xì)胞層內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)亞克隆ICM細(xì)胞干細(xì)胞上皮細(xì)胞展平ES細(xì)胞用電穿孔對ES細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化DNA線性化轉(zhuǎn)基因DNA59用G418選擇生長的neor細(xì)胞系鑒別含有破壞基因的ES細(xì)胞用轉(zhuǎn)基因引物進(jìn)行PCR分析用轉(zhuǎn)基因探針進(jìn)行DNA印跡60

剔除（knockout）

（1）首先是將想要剔除的小鼠基因插到載體上進(jìn)行克隆。再將新霉素抗性(neor)標(biāo)記插入這個基因，使這個基因受到破壞，這段DNA稱為定向插入DNA。在此基因外側(cè)再導(dǎo)入一個胸苷激酶（tk）基因，作為選擇標(biāo)記。（2）從棕色小鼠的胚中分離，收集胚胎干細(xì)胞（embryonicsterm,ES），將重組載體轉(zhuǎn)染ES；61(3)轉(zhuǎn)染后會產(chǎn)生三種不同的結(jié)果：

①載體上定向插入DNA和染色體上的靶基因進(jìn)行同源重組，使染色體上帶有了定向插入DNA(即被破壞了的基因)和neor，但不帶有外側(cè)的tk

；②重組載體隨機(jī)插入到染色體中，未進(jìn)行同源重組；③重組載體未能插入到染色體中；受體染色體未發(fā)生改變。62(4)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入G418和GCV

(9-1,3-二羥-2-丙氧甲基鳥苷

)，neor可將具有定向插入DNA的細(xì)胞選擇出來；GCV可殺死所有帶有tk的細(xì)胞，這樣可將隨機(jī)插入和未重組的細(xì)胞都?xì)⑺?。最后培養(yǎng)基上僅留下帶有定向插入的細(xì)胞。

(5)將帶有定向插入的細(xì)胞（A/A；M/m）注入黑色雌鼠(a/a；M/M)的囊胚腔中,使胚胎成為嵌合體。

(6)將嵌合胚植入作為代理母親的黑色雌鼠子宮里，嵌合體發(fā)育成嵌合小鼠（帶有黑色斑紋的棕色小鼠）。63

(7)嵌合小鼠發(fā)育成熟后，選擇雄性小鼠（a/a,M/M;A/A,M/m）和黑色雌鼠(a/a；M/M)雜交，生育的子代中有：①黑色鼠（a/a；M/M

）；②棕色鼠（A/a,M/m

）；③棕色鼠（A/a,M/M）。

(8)再將棕色鼠（A/a,M/m）互交，將產(chǎn)生4種不同基因型的后代：①A/-,M/-

(棕色)；②A/-,m/m

(棕色)，是我們要得到的純合的剔除基因小鼠。③a/a,M/-（黑色）。

64定點(diǎn)突變棕色鼠正常的染色體a/a：M/M黑色母鼠從棕色鼠分離出胚胎干細(xì)胞囊胚階段的胚代理母親生育的嵌合雄鼠(帶有兩種小鼠的細(xì)胞系)胚胎A/A：M/Ma/a：M/M+A/A：M/m嵌合的的胚

6566

尋靶載體

(targetingvectors)

有兩種基本的基因?qū)ぐ蟹椒ā?/p>

(1)最簡單的方法是依賴一個基因插入的過程，此需要尋靶載體的末端和基因組之間的交換。通過插入產(chǎn)生的結(jié)果是靶序列和具有選擇標(biāo)記（如neor）的插入序列重復(fù)。

(2)第二種是用基因置換的方法?；蛑脫Q載體含有兩個選擇標(biāo)記，提供了一個鑒別ES細(xì)胞是否在靶基因發(fā)生了雙交換的方便方法。

67通過插入來敲除基因基因組用G418來選擇neor基因neorampr68通過置換來敲除基因用G418來選擇neor基因用9-鳥嘌呤選擇HSVtk缺失69

三、人類疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型

小鼠轉(zhuǎn)基因的一個目的是用分子遺傳學(xué)的方法產(chǎn)生人類疾病的模型，來了解遺傳缺陷。

1996年哈佛醫(yī)學(xué)院C.Tabin實(shí)驗室提出發(fā)現(xiàn)IHh控制骨頭的發(fā)育；

1999年哈佛的A.McMahan發(fā)現(xiàn)剔除小鼠IHh基因后有許多異常，包括骨頭縮短。

2001賀林等將A-1型短指（趾）癥的致病基因定位于2號染色體長臂的35－36區(qū)，并發(fā)現(xiàn)IHH（Indiahedgehog）基因的3個不同突變位點(diǎn)均能導(dǎo)致短指（趾）癥的發(fā)生。70用培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞敲除Hoxc-8基因。(a)Hoxc-8突變小鼠的胸椎和腰椎。野生型小鼠的第一腰椎是沒有肋骨的。(b)純合的敲除Hoxc-8基因小鼠（右）的趾緊握。野生型（左）小鼠的趾正常71第四節(jié)轉(zhuǎn)基因家畜基因動物用于生產(chǎn)具有藥用價值的重組蛋白的生物反應(yīng)器（bioreactors）。用轉(zhuǎn)基因制備藥物的這項工作發(fā)展緩慢，其原因是：（1）大型家畜的轉(zhuǎn)基因傳代時間長，后代少。另外由于卵細(xì)胞的顯微注射導(dǎo)致DNA的隨機(jī)整合，結(jié)果使基因表達(dá)出現(xiàn)遺傳變異，產(chǎn)生不可預(yù)知的后果。（2）公眾關(guān)心來自轉(zhuǎn)基因動物的食品，如人源化的牛奶可能不被消費(fèi)者廣泛接受。（3）動物保護(hù)主義者質(zhì)疑轉(zhuǎn)基因是否會減少生物的多樣性，大規(guī)模生產(chǎn)的程序是否影響到動物的安全。72一．用轉(zhuǎn)基因動物制備藥物1992年，英國愛丁堡大學(xué)的研究人員生產(chǎn)出6頭轉(zhuǎn)基因綿羊。這些綿羊可以在奶中生產(chǎn)抗胰蛋白酶（一種治療肺胞纖維化病變的多肽藥物），產(chǎn)量最低的是1g/L，產(chǎn)量高的可達(dá)35g/L。這篇研究報告立即在科學(xué)界和企業(yè)界引起轟動，許多正在進(jìn)行相關(guān)領(lǐng)域研究的科學(xué)家紛紛將目標(biāo)移向建立乳房反應(yīng)器系統(tǒng)來合成作為藥物的重要蛋白。737475用DNA共轉(zhuǎn)染的分子遺傳學(xué)和核移植技術(shù)是能產(chǎn)生產(chǎn)藥動物。此圖表示羅斯林研究所的科學(xué)家們用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到從無角多塞特白面母綿羊分離出的二倍體胚細(xì)胞中，

所用的載體是帶含有人類IX因子cDNA的乳腺特異表達(dá)載體(pMIX1)。在IX因子編碼序列的上游是綿羊的β-乳球蛋白(BLG)

啟動子。使異源基因在綿羊的乳腺中能高水平的表達(dá)。以這種共轉(zhuǎn)染的方法，另一個質(zhì)粒含有來自磷酸甘油酸激酶啟動子(pPGKneo)的neor

基因，提供了一個用G418

來選擇的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的選擇標(biāo)記莫莉和波莉是首批兩只轉(zhuǎn)基因產(chǎn)藥動物。這兩只羊含有有產(chǎn)藥價值的人類基因。

76

二、動物的體細(xì)胞克隆英國愛丁堡蘇格蘭羅斯林研究所和英國PPL醫(yī)療公司的IanWilmut

和

KeithCampbell等從一頭６歲芬蘭多塞特白面母綿羊的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低血清的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，進(jìn)入G0期，以便和受體的細(xì)胞周期同步。77

此細(xì)胞作為“供體細(xì)胞”。再從一頭蘇格蘭黑面母綿羊的卵巢中取出未受精的卵細(xì)胞，并通過顯微操作儀將細(xì)胞核除去，留下一個無核的卵細(xì)胞，作為“受體細(xì)胞”。用電穿孔使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合。融合細(xì)胞經(jīng)6天的培養(yǎng)，細(xì)胞分裂、分化，一共產(chǎn)生29個多細(xì)胞的“胚胎”；最后將這些“胚胎”轉(zhuǎn)移到13頭蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，經(jīng)過148天的發(fā)育分化，最后產(chǎn)下了一頭成活的小綿羊，羅斯林研究所的科學(xué)家們以他們最喜歡的鄉(xiāng)村歌手DollyParton

的名字來命名這頭小羊。

78蘇格蘭黑面母綿羊芬蘭多塞特白面母綿羊從乳腺中分離二倍體體細(xì)胞從卵巢中分離卵細(xì)胞用顯微操作除去單倍體核用低血清培養(yǎng)使細(xì)胞處于G0期79通過電穿孔使細(xì)胞融合培養(yǎng)6天將囊胚移植到作為代理母親的黑面羊子宮里150天后生下小羊多莉80歌手DollyPartonNature,385(1997),封面81

動物體細(xì)胞克隆中存在的問題。①體細(xì)胞克隆時，如何恢復(fù)雌性供體中失活的X染色體的活性？例如2001年美國得克薩斯農(nóng)業(yè)和機(jī)械大學(xué)

M.Westhusin等成功地克隆出了小貓“科比”。科比的供體是三色貓，其遺傳結(jié)構(gòu)應(yīng)和供體相同，但毛色和供體卻有一定差異。如果克隆動物的X染色體上帶有突變基因，那么，也可能因缺乏相應(yīng)的野生型等位基因而致病。82(a)克隆貓“科比”的供體(b)克隆貓“科比”和其代理母親(c)克隆貓“科比”2001年第一只克隆貓“科比”誕生。其供體是一只三色貓（a）其代理母親是一只灰色帶黑色條紋的貓（b）而“科比”的花色模式和其供體相同，但僅有黑和白兩種毛色。表明其來自單克隆細(xì)胞。83②如何恢復(fù)端粒的長度？當(dāng)多莉兩歲半時，人們測定其端粒的長度與核供體的年齡一致，而不與其本身實(shí)際年齡不一致。因近年來研究表明，端粒長度的縮短與哺乳動物的疾病和衰老密切相關(guān)。核移植后，端粒長度變化的機(jī)理如何？對動物壽命的影響如何都需要進(jìn)一步研究。84③如何實(shí)現(xiàn)正常的親本印記（parentalimprinting）？

這些表觀遺傳標(biāo)記建立于生殖細(xì)胞，而在所有體

細(xì)胞中得到維持。實(shí)驗表明僅含有母源基因組

(孤雌生殖)或者僅包含父源基因組(雄核發(fā)育)的胚胎都在發(fā)育過程中常常表現(xiàn)異常。體細(xì)胞克隆動物未經(jīng)過受精，也是來源單個親本，只能維持親本的遺傳印記，如有遺傳缺陷后代就難以避免。所以就有必要利用靶向修飾（甲基化或去甲基化）改變這種情況。85

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)藥動物1997年12月羅斯林研究所又誕生了兩只轉(zhuǎn)基因羊羔，叫“莫莉（Molly）”和“波莉（Polly）”是首批兩只轉(zhuǎn)基因產(chǎn)藥動物。這些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)藥動物是用哺乳動物含有人類凝血因子IXcDNA的乳腺特異表達(dá)載體(pMIX1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞而產(chǎn)生的，而供體細(xì)胞是來自動物胚胎細(xì)胞。

莫莉和波莉不僅彼此遺傳性相同，帶有相同的綿羊基因，而且將來在每一個羊羔的乳汁中又可產(chǎn)生大量的人類血凝因子IX。86pMIX1pPGKneo脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染蘇格蘭黑面母綿羊無角多塞特白面母綿羊用顯微操作除去單倍體核分離二倍體胚胎細(xì)胞用G418-選擇并分離克隆鑒定的DNApPGKneo

＋pMIX1只有pPGKneoβ-乳球蛋白啟動子87通過電穿孔使細(xì)胞融合培養(yǎng)6天將囊胚移植到作為代理母親的黑面羊子宮里150天后生下小羊波莉莫莉產(chǎn)藥動物88

乳房反應(yīng)器系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：（1）利用高等哺乳動物乳腺的特異基因啟動子可直接表達(dá)人類可溶性轉(zhuǎn)基因蛋白。（2）動物乳腺細(xì)胞可以使任何基因正確表達(dá)和加工。生產(chǎn)出來的蛋白質(zhì)與天然產(chǎn)品在結(jié)構(gòu)和功能相同；（3）由于乳汁蛋白不會輸送到轉(zhuǎn)基因動物的血流和淋巴流中，因此不會對轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生對有害的副作用。（4）乳中的蛋白質(zhì)種類較少，轉(zhuǎn)基因在奶中表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)量高，易于提純。89

檀香山技術(shù)(Honolulutechnique)

夏威夷大學(xué)的Wakayama等報導(dǎo)了另一項突破。表示他們建立的稱為“檀香山技術(shù)”產(chǎn)生了一只名叫“卡姆莉(Cumulina)”。檀香山技術(shù)和羅斯林研究所的方法之間的差別是：（1）使用卵丘細(xì)胞，處于自然休眠期(Go)，不需“饑餓培養(yǎng)”；（2）將核直接注入去核的卵中，方法簡便。（3）重構(gòu)的卵母細(xì)胞的激活采用化學(xué)法-鍶離子（電脈沖）；（4）提高了成活率至2.35%，比多莉羊高5-6倍(Dolly1/277)。90

檀香山核轉(zhuǎn)移技術(shù)利用微注射產(chǎn)生二倍體卵細(xì)胞來克隆動物。通過將經(jīng)微注射的卵放在含有鍶的無血清培養(yǎng)基中在體外激活卵母細(xì)胞，

在激活卵母細(xì)胞中含有的細(xì)胞松弛素B能阻止極體形成，這是由于使其丟失了染色體。

91除去原核的單倍體卵細(xì)胞從二倍體體細(xì)胞中取出核將二倍體核注入卵細(xì)胞中92在體外激活卵母細(xì)胞并進(jìn)行胚胎培養(yǎng)將胚植入假孕母鼠的子宮里93在1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。

94第五節(jié)實(shí)踐7：敲除轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)生特異基因

一、研究目的一個研究生設(shè)計了一項實(shí)驗來驗證在腦中豆極基因(bean

pole，b